基于微环境调控的脂肪酶固定化方法的研究
脂肪酶(EC3.1.1.3)具有催化条件温和、选择性高和环境友好的特点，被广泛用于绿色化学品的合成。通过固定化策略来增强酶的活性和稳定性是现在脂肪酶在工业应用中的一个重要手段，载体表面微环境也是近几年研究的一个热点。本文选择弹性载体聚氨酯泡沫和大孔树脂为载体，针对载体特性分别建立了基于微环境调控的脂肪酶固定化的新方法，通过微环境的调控提高固定化Yarrowialipolytica脂肪酶(YLIP2)的活力和稳定性，并且研究了微环境的改变和固定化酶的性能的关系。
主要工作如下:
1、采用0.2％的聚乙烯亚胺(PEI)涂层聚氨酯泡沫制备氨基化载体并固定化YLIP2。比较了PEI涂层载体4种不同的固定化方式，其中利用戊二醛活化后的共价固定化效果最好，并且固定化酶的活力与PEI的分子量和固定化方式相关，在PEI的分子量为70000Da时，固定化酶活比非氨基化的固定化酶提高了1.7倍。与游离酶和直接吸附固定化酶相比，PEI载体表面的固定化酶的稳定性得到了很大的提升。游离酶在50℃下缓冲液中处理30分钟之后，保留活力只剩下不到最初的5％，而PEI固定化酶仍保留最初活力的70％，表明共价固定化酶对热失活表现较好的抗性。圆二色谱分析也证明了PEI可以保护酶的二级结构。紫外分光光度计和荧光光谱进行了分析。另外，本文还通过扫描电镜(SEM)、衰减全反射傅立叶变换红外分析(ATR/FT-IR)和元素分析对载体改性前后的载体性质进行了研究。
将固定化酶应用于实际酯合成反应体系。在有机相中催化十二酸十二醇酯的合成，采用PEI涂层的共价固定化酶表现出良好的操作稳定性。在连续使用30批之后，共价固定化酶催化合成的酯含量仍维持在88％。结合载体的弹性特征设计了相应的新型反应器的设计，该酶在催化合成棕榈酸异辛酯表现出良好的稳定性，连续操作10批时，转化率仍维持在90％。研究不仅证明了聚氨酯泡沫可以作为一种廉价和有效的酶固定化载体，同时也为通过载体的微环境设计提高固定化酶的活性和稳定性提供了一个具体的实例。
2、以大孔树脂为载体，研究了不同的微环境修饰技术，采用不同类型（二胺类、树枝状分子、蛋白类）、不同分子量大小的间臂分子对载体表面进行修饰，改善固定化表面的微环境。通过不同改善方式得到的活力均有不同程度的提升，其中，明胶修饰后载体固定化酶的活力比未修饰的提高2倍，并且在连续使用35批后，转化率仍有80％，获得比未修饰的固定化酶更好的操作稳定性。最后，还将此种固定化方法应用在商业化载体Eupergit C2501上面，验证了这种固定化方法在不同载体上的通用性。
3、在前面研究基础上，这里引入了混合模式的固定化方法对固定化酶微环境的影响。采用疏水的正丁胺和具有生物相容性的明胶同时对载体表面环境进行改造，开发出一种高效的固定化YLIP2的方法，得到的酶活可以提高为修饰的至7倍，而单独对载体进行修饰时只可以提高2-2.5倍。说明了采用这种方法对载体表面微环境进行改造是一个十分有力的手段。
4、研究了添加剂对酶活的影响。分别对多种添加剂修饰载体和添加剂对发酵液储藏中的作用进行了研究。在发酵液储藏过程中加入山梨酸钾作为保护剂，可以促进酶活的提高，并且在长期保存150天之后，酶活仍维持在初始的50％左右。
脂肪酶;聚乙烯亚胺;混合模式
北京化工大学
硕士
化学工程与技术
陈必强
2013
中文
Q814.2
129
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）