合成阿莫西林用青霉素酰化酶在大肠杆菌中的表达
阿莫西林是一种广谱性青霉素类半合成抗生素，在我国及世界范围内有着广泛的应用。应用具有特异性、反应条件温和，产物中杂质含量少，对环境污染小的酶法合成阿莫西林工艺是工业生产阿莫西林最好的选择。青霉素G酰化酶(PGA)是催化合成阿莫西林反应所用的关键酶，但在阿莫西林的合成过程中还伴随阿莫西林的水解反应。经调研可知来源于Achromobacter sp CCM4824菌上的青霉素酰化酶具有较高的合成活性。
本文通过DNAworks在线分析软件对Achromobacter sp CCM4824上的青霉素酰化酶基因进行优化使其适合在大肠杆菌中表达，并对优化后的基因直接进行人工合成。
利用基因工程手段，将合成的PGA基因分别克隆到pET01-T和pET28a表达载体中，构建了诱导型重组质粒pET01-PGA、pET28a-PGA，并将其分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌BL21(DE3)/pET01-PGA和BL21(DE3)/pET28a-PGA表达的PGA酶活分别为30U·L-1、105 U·L-1，单位菌体浓度下，后者表达的PGA酶活比前者高147％。SDS-PAGE显示二者均有无活性的PGA前体包涵体产生。
为了减少无活性包涵体的形成，构建了具有相对较弱启动PGA表达的pUCK-lac-PGA、pUCK-HP-PGA组成型表达质粒，通过对不同宿主菌的选择，最终确定表达效果最好的宿主菌为E.coli BL21。重组菌BL21/pUCK-lac-PGA、BL21/pUCK-HP-PGA表达的酶活分别为198U·L-1(OD600为3.24)、336U· L-1(OD600为4.82)。
通过对重组菌E.coli BL21/pUCK-HP-PGA进行培养条件的优化，最后确定最适培养温度为32℃、初始培养基pH值为6.0、装液量为70/150mL。在此条件下表达的PGA酶活为371U·L-1(OD600为3.20)，比酶活较优化前提高了65.7％。
青霉素酰化酶;阿莫西林;大肠杆菌;基因克隆
北京化工大学
硕士
微生物与生化药学
阎爱侠;王文雅;李强
2013
中文
TQ465.1
80
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）