酶法制磷脂酰丝氨酸
磷脂酰丝氨酸(PS)是一种具有良好脑神经系统促进作用的磷脂。天然存在的PS量很低，且不容易提取，成本极高，因此人工合成价廉高效的PS成为当今科研研究的重要议题。
1.PS的合成研究中，由于PS具有低UV吸收、不稳定以及温感强的特性，给检测带来了很大的难度且效果一直不好，本文首次尝试用HPLC/ELSD测定丝氨酸的降解率来衡量产物的生成量，建立了一种检测产物PS的新方法，该方法简便易行，稳定可靠，并从侧面反应了磷脂酶D的转酯活性。
2.利用一系列统计学方法优化两相反应体系的主要反应条件，在单因素优化的基础上通过正交实验确定对反应体系影响显著的因素;然后利用中心组成设计(CCD)和响应面法(RSM)获得生产PS的最优反应体系，转化率可达到55％。
3.本文研究了PS的纯化体系，确定了合成PS的酶系纯化方法，经过一系列纯化过程后得到的PS的比活力比粗酶液提高了21.7倍，酶活力回收率10.56％。蛋白电泳显示清晰单一条带，基本达到了电泳纯，分子量为40KDa，为工业化酶法生产丝氨酸磷脂奠定了基础;
4.PLD酶学性质研究结果显示，本实验室发酵生产的PLD的催化水解反应的最适pH值为6，pH5-7之间比较稳定;最适水解温度为40℃，温度低于60℃活性较稳定;转酯反应的最适pH值为5.8，在pH4-7之间比较稳定;最适转酯温度为32℃，温度低于50℃活性较稳定;该磷脂酶D在4℃下保存稳定性较好，半衰期长达98天。与文献相比，实验室这株菌更耐高温和耐酸。
5.测定了该株具有转酯活性的链霉菌属PLD的未知核酸序列，此序列之前没有被报道到，具有很好的创新性及研究价值。通过获取磷脂酶D基因序列，连接至pETDuet-1质粒中。重组大肠杆菌pETDuet-1-PLD/BL21由化学法转化而得。在诱导表达重组菌24小时后催化转酯活性的转化率达55.6％，可能由于分析方法导致误差，表达量还有上升的空间。
磷脂酶;基因工程;磷脂酰丝氨酸;发酵生产
北京化工大学
硕士
微生物与生化药学
袁其朋
2013
中文
TQ464
84
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）