基于反义RNA技术降低发酵生产3-羟基丙酸中的副产物
3-羟基丙酸(3-HP)性质极为活泼，可用于合成多种物质。3-HP的微生物发酵生产是目前研究的热点，而发酵的副产物严重影响3-HP的纯度及后期的分离纯化。本文以肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae为宿主，利用反义RNA技术，对副产物做了研究。
1、克隆了K.pneumoniae中的醛脱氢酶基因puuC，连接至表达载体pET-PK构建重组质粒pET-PK-puuC，电击转化至宿主K.pneumoniae DSM2026，得到重组菌K.p（pET-P K-puuC）。微氧摇瓶发酵结果表明:重组菌3-HP产量为0.86 g/L，较对照菌K.p(pET-PK)提高了0.21 g/L，甘油转化率和单位菌体产量分别提高了87.5％和61.9％。
2、采用反义RNA技术，克隆了K.pneumoniae中乳酸产生的关键酶乳酸脱氢酶基因lldD片段，构建了重组质粒pET-PK-lldD，转化得到重组菌K.p(pET-PK-lldD)。微氧摇瓶发酵结果表明:重组菌中乳酸产量为0.27 g/L，与野生型及携带空质粒的菌株相比，乳酸的产量分别降低了69％、71％。
3、克隆了K.pneumoniae中乙酸产生的催化酶磷酸乙酰转移酶基因pta及丙酮酸脱氢酶基因poxB，构建了重组质粒pET-PK-pta，pET-PK-poxB，转化得到重组菌株K.p（pET-PK-pta）、K.p(pET-PK-poxB)。重组菌微氧摇瓶发酵结果表明:K.p(pET-PK-pta)乙酸产量为0.18 g/L，K.p（pET-PK-poxB为0.25 g/L，两株重组菌比野生菌乙酸产量2.25 g/L分别降低了92％、89％。
4、在pET-PK-lldD质粒上分别连入了pta、poxB片段基因，构建重组质粒pET-PK-lldD-pta和pET-PK-lldD-poxB(简称pET-La、pET-LB)，转化得到重组菌株K.p(pET-La)、K.p(pET-LB)。微氧摇瓶发酵结果表明:K.p(pET-La)中乳酸产量为0.32 g/L，K.p(pET-LB)乳酸产量0.18 g/L，较野生菌分别降低了约65％和80％，K.p(pET-La)、K.p(pET-LB)中乙酸产量均为0.23 g/L，与野生菌相比，分别降低了91％和79％。
5、克隆了来自大肠杆菌Escherichia coli中的醛脱氢酶基因aldH，连接至已构建好的pET-La、 pET-LB质粒，构建重组质粒pET-La-aldH、pET-LB-aldH，转化得到重组菌K.p(pET-La-aldH)和K.p(pET-LB-aldH)。微氧摇瓶发酵结果表明:K.p(pET-La-aldH)产3-HP1.14 g/L，乳酸0.26 g/L，乙酸0.42 g/L，K.p(pET-LB-aldH)产3-HP1.23 g/L，乳酸0.29 g/L，乙酸0.36 g/L。与野生菌相比，3-HP产量分别提高了44.3％和55.7％，乳酸均降低了约70％，乙酸分别降低了83.1％和85.5％。
肺炎克雷伯氏菌;醛脱氢酶;羟基丙酸;乳酸;乙酸;发酵生产
北京化工大学
硕士
微生物与生化药学
田平芳
2013
中文
TQ920.1
102
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）