吡咯喹啉醌工程菌构建及关键基因研究
吡咯喹啉醌(PQQ)，是一种新型辅酶，利用微生物产PQQ是目前研究的热点也是难点，本论文以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌(E.coli BL21)为宿主菌，采用诱变和分子生物学的方法，从以下几个方面筛选和构建了PQQ的高产菌，并确定了PQQ的高效液相色谱(HPLC)法检测PQQ的条件。
1、本论文以K.pneumoniae为出发菌株，采用紫外诱变、氯化锂诱变、以及二者复合诱变，然后用非酶法检测PQQ产量，所得3株菌U1，U2和L1的PQQ产量较高且遗传稳定，分别是出发菌株的6倍、2.7倍和5倍。利用紫外线-氯化锂进行复合诱变得到一株是出发菌株产量1.4倍的菌株。
2、本论文对PQQ的HPLC检测条件进行了探索，综合PQQ的特殊结构及文献报道，通过不同波长、不同流速时PQQ吸收峰的对比，最终确定了最佳检测条件为以水和甲醇、磷酸为流动相（体积比为95％∶5％∶5‰），流速0.8ml/min，波长200 nm。同时以不同浓度的PQQ标准品绘制了PQQ浓度的标准曲线，R2达到0.9936。
3、本论文首次从PQQ的分泌表达方面入手，通过克隆大肠杆菌中的孔蛋白OmpA，phoE，与含卡那霉素启动子的pET-28a-kan相连，同时根据不同抗性的质粒可以在同一菌株中共存，克隆氯霉素抗性基因替换载体上的卡那抗性基因。得到PQQ产量最高为双质粒工程菌K.p(pET-kan-pqq，pET-kan-phoE-Cm)，最高为224.82 mg/L，比原始菌株K.p提高了116.65％，为PQQ分泌表达奠定了基础。
4、本论文克隆了pET-22b载体上的信号肽序列，将其连接到载体pET-28a-pqq上的T7启动子之后，pqq基因簇之前，对构建好的工程菌E.coli BL21(pET-28a-pelb-pqq)进行发酵，PQQ最大产量达到40.73 mg/L，比对照菌E.coliBL21(pET-28a-pqq)提高了20.68％，说明信号肽的表达促进了PQQ的分泌，提高了PQQ的产量。
5、本论文利用不同抗性构建了同时含有表达载体pET-28a-pqq和pET-22b-gcd的双质粒工程菌E.coli BL21(pET-28a-pqq，pET-22b-gcd)，48 h后90％的细胞能同时含有两个质粒，双质粒工程菌的PQQ产量最高可达199.8 mg/L，是对照菌E.coli BL21(pET-28a-pqq)的4倍，且该工程菌的生长速度比单质粒的工程菌快，其葡萄糖利用率也明显提高，为PQQ和葡萄糖脱氢酶的耦合代谢途径的进一步研究奠定了基础。
吡咯喹啉醌;肺炎克雷伯氏菌;大肠杆菌;孔蛋白;信号肽;葡萄糖脱氢酶;双质粒共表达
北京化工大学
硕士
微生物与生化药学
田平芳
2013
中文
TQ464.8
101
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）