农杆菌介导T-DNA转化黑曲霉的初步研究
木聚糖是植物细胞中半纤维素的主要成分，是一种丰富的生物质资源。其降解产物及生物转化产物应用广泛，降解木聚糖的酶系主要包括木聚糖酶和木糖苷酶等，而黑曲霉是产木聚糖酶的主要菌种。本论文从分子水平对实验室保存的一株产酶菌株-黑曲霉2459进行遗传性能的改造，以提高菌株的产酶活力，具体研究内容如下:
(1)载体pBI-hph的构建:首先尝试通过不完全酶切的方法获得潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)表达盒，但经多次实验仍不能获得，之后用PCR的方法获得表达盒，与Ti质粒pBI121载体大片段连接，在大肠杆菌DH5α中筛选得到含有hph表达盒的载体pBI-hph，用冻融法转化到农杆菌EHA105中。
(2)农杆菌介导的黑曲霉转化系统的建立:首先通过平板筛选的方法分别确定潮霉素B对黑曲霉的最小抑制浓度为60μg/ml，头孢噻肟对农杆菌的最小抑制浓度为150μM;采用农杆菌介导的方法，将载体pBI-hph转化到黑曲霉2459中。然而，通过转化效率的比较，发现载体pPK2的转化效率比载体pBI-hph的转化效率高的多，为实验方法研究的方便，选用载体pPK2继续研究。对黑曲霉转化菌株全基因组DNA提取后进行PCR验证，并通过继代筛选的方法研究了转化菌株的遗传稳定性，结果表明:通过农杆菌介导的方法成功地将载体pBI-hph转化到黑曲霉基因组上，所得转化菌株能够稳定的遗传。
(3)转化条件的优化:从农杆菌的诱导时间、乙酰丁香酮(AS)的浓度、培养基pH、受体形式等方面对转化过程进行优化，得到较优的转化条件:农杆菌的诱导时间4小时、乙酰丁香酮的浓度200μM、培养基的pH4.75、农杆菌的初始浓度OD600=0.7、共培养时间36小时、受体形式以匀浆处理的黑曲霉菌体为好，在这些条件下pPK2对黑曲霉的转化效率可达到120个/107个孢子;通过对转化菌株木聚糖酶活测定，筛选得到酶活较黑曲霉2459提高86％的转化菌株。
(4)高产木糖苷酶黑曲霉菌株的初步构建:分别对保存在pGEM-TEasy Vector上的木糖苷酶基因XlnD，以及从质粒pPK2上PCR获得的启动子Pgpd、终止子TtrpC的两端设计引物，每两段之间加有15bp的碱基重叠，经PCR反应并纯化，同时对质粒pPK2进行HindⅢ单酶切并纯化，将各目的片段在In-Fusion HD Cloning Kit中进行连接反应，转化到大肠杆菌DH5α中。对转化单菌落进行菌落PCR及质粒单酶切验证，并将符合条件的单菌落质粒提取后进行测序，结果表明成功将木糖苷酶基因插入到载体pPK2上，为高产木糖苷酶黑曲霉菌株的构建奠定了基础。
双元载体;农杆菌介导;黑曲霉;木聚糖酶;木糖苷酶
北京化工大学
硕士
微生物与生化药学
王文稚
2013
中文
Q939.97;Q949.327.1
84
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）