生物柴油基因工程菌的构建
生物柴油具有可完全燃烧、再生降解等优点，已受到许多国家的高度关注与重视。目前，生物柴油主要为由长链脂肪酸与短链醇反应生成的重质型生物柴油，其生产原料主要来源于动植物油脂，存在着与人争粮的局面且价格较高，是制约生物柴油发展的重大因素。因此寻找廉价易得原料并利用非食用油脂合成轻质生物柴油是未来的发展方向。随着生物学的发展，通过基因工程手段控制已有微生物脂肪酸代谢途径合成性能优良的轻质型生物柴油是生物柴油发展的趋势。所以利用基因工程菌发酵生产轻质生物柴油具有重要的现实意义。
本文主要研究工作如下:
(1)大肠杆菌中调控脂肪酸代谢关键硫酯酶基因的研究，以大肠杆菌K-13的基因组为模板扩增硫酯酶基因(tesA')，构建该基因在大肠杆菌中的同源表达系统pETDuet-tesA'，并在大肠杆菌BL21中表达。通过蛋白电泳在预测分子量21KDa处获得极微量目的条带，效果不是很明显。
(2)萼距花属、月桂树和香樟树三种植物中调控脂肪酸代谢关键特异性硫酯酶基因的研究，以经密码子优化后化学合成的三种硫酯酶基因为模板，设计不同引物和酶切位点PCR扩增得到不同特异性的硫酯酶基因:chFatB，ucFatB，ccFatB。分别构建了这三个基因在大肠杆菌中的异源表达系统pETDuet-chFatB，pETDuet-ucFatB，pETDuet-ccFatB，并在大肠杆菌BL21中进行表达得到工程菌 pDchFatB，pDucFatB，pDccFatB。这三个表达系统通过蛋白电泳在33KDa处获得了目的条带，工程菌pDchFatB成功地使大肠杆菌生成172mg/L的脂肪酸，同空白对照菌190mg/L的产量相比，产量没有提高，但在脂肪酸种类上生成了C8、C10的特异性中链脂肪酸;pDucFatB成功地使大肠杆菌生成473mg/L的脂肪酸，同空白对照菌相比，产量有明显提高，是空白对照菌产量的2.5倍，且在脂肪酸的种类上，工程菌产生了中链的C10、C12、C14的脂肪酸;pDccFatB成功地使大肠杆菌生成234mg/L的脂肪酸，同空白对照菌相比，产量有一定提高，比空白对照菌产量提高了23.2％，且在脂肪酸的种类上，工程菌产生了中链的C14的脂肪酸。
(3)产轻质生物柴油基因工程菌的构建，以不动杆菌ADP1基因组为模板扩增得到高度非特异性的酰基转移酶基因atfA，构建该基因在大肠杆菌中不同的双基因异源表达系统pETDuet-chFatB-atfA，pETDuet-ucFatB-atfA，pETDuet-ccFatB-atfA，并在大肠杆菌BL21中进行表达得到工程菌pDchA，pDucA，pDccA。工程菌pDchA通过蛋白电泳在41KDa处只有极微量的目标条带，其余两个工程菌pDucA和pDccA通过蛋白电泳在41KDa处有很明显的目标蛋白条带。pDchA未能成功地使大肠杆菌生成中链脂肪酸乙酯;pDucA成功地使大肠杆菌生成7.6mg/L的脂肪酸乙酯，而空白对照菌中无脂肪酸乙酯的生成，且在脂肪酸乙酯的种类上，工程菌产生了中链的C12、C14的中链脂肪酸乙酯;pDccA成功地使大肠杆菌生成6mg/L的脂肪酸乙酯，而空白对照菌中无脂肪酸乙酯的生成，且在脂肪酸乙酯的种类上，工程菌产生了中链的C14的中链脂肪酸乙酯。最后进一步的分析表明pDucA和pDccA工程菌胞内仍存在8.5mg/L与8.7mg/L的脂肪酸未在酰基转移酶的作用下与乙醇反应生成相应的脂肪酸乙酯。所以后续优化乙醇流加量(1％-5％)，最终得出最佳的乙醇流加量为3％。
(4)产乙醇基因工程菌的构建，以克雷伯氏菌基因组为模板扩增得到丙酮酸脱羧酶(PDC1)和乙醇脱氢酶(AdhE)，构建这两个基因在大肠杆菌中单基因与双基因表达系统pETDuet-PDC1、pETDuet-PDC1-AdhE，并在大肠杆菌BL21中进行表达。单基因表达系统通过蛋白电泳在61KDa处有明显的目标条带，双基因表达系统通过蛋白电泳在96KDa处有很明显的目标蛋白条带。发酵培养显示单基因工程菌中乙醇产量为88mg/L，同空白对照菌株的产量75mg/L，提高幅度较小。双基因工程菌最终发酵液中乙醇产量为250mg/L，是空白对照菌株产量的3倍。
大肠杆菌;生物柴油;脂肪酸乙酯;硫酯酶;酰基转移酶
北京化工大学
硕士
微生物与生化药学
王芳
2013
中文
TQ517.2
105
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）