基于蛋白酶催化位点分离硫酸软骨素与胶原蛋白
硫酸软骨素(chondroitin sulfate)简称CS，在体内以蛋白多糖的形式存在于软骨等组织基质中，与蛋白多糖中的核心蛋白以共价键相结合。硫酸软骨素是一种酸性糖胺聚糖，由重复二糖单位的葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以β-1，4糖苷键连接而成。一般含有20～60个重复二糖，相对分子量为5000～50000Dal。硫酸软骨素具有治疗高血脂，心绞痛，改善血液供应、降低血清胆固醇、预防和治疗关节畸形等多种药理作用，因此广泛应用于临床、医药、和保健食品等领域。
本课题以清真屠宰场的新鲜牛喉骨软骨为原料，以硫酸软骨素的纯度为主要考察指标，采用碱-单酶酶解法、碱-双酶酶解法分离硫酸软骨素与胶原蛋白。
1.在碱-菠萝蛋白酶酶解法中，首先以硫酸软骨素的得率为主要的考察指标，优化了碱提取法的生产工艺及参数。优化工艺条件:提取温度40℃，料液比为1∶7，提取时间2h，碱液浓度6％，然后优化了菠萝蛋白酶酶解工艺，优化工艺条件:酶用量0.08％、pH值6.0、酶解温度40℃、酶解时间2h，产品的得率为18.56％，氨基己糖含量为28.13％，产品纯度为79.32％。
2.在碱-胰蛋白酶酶解法中，以硫酸软骨素的纯度为主要的考察指标，在碱提取的基础上选择胰蛋白酶（动物蛋白酶）进一步分离CS与胶原蛋白。优化工艺条件:pH值9.0，酶用量0.09％，酶解温度48℃、酶解时间2.5h，产品的得率为35.40％，氨基己糖含量为34.26％，产品纯度为96.64％。
3.在碱-碱性蛋白酶酶解中，以硫酸软骨素的纯度为主要的考察指标，在碱提的基础上选择碱性蛋白酶进一步分离CS与胶原蛋白。优化工艺条件:酶解时间2.0h、pH9.0、酶用量0.09％、酶解温度52℃，CS产品的得率为35.56％，氨基己糖含量为34.88％，纯度为98.36％。
4.在碱-双酶法酶解中，以硫酸软骨素的纯度为主要的考察指标，在碱提的基础上，根据碱-单酶法试验结果，进行双酶复合提取硫酸软骨素，其中碱性蛋白酶与胰蛋白酶复合提取中复合酶配比为1∶0.6时，pH9.0，酶解温度52℃，酶解时间2h，CS产品得率为30.28％，氨基己糖含量为33.74％，纯度为95.15％。
5.对硫酸软骨素分离提取工艺优化条件进行小试研究，主要是对试验结果进行验证及对比研究。根据国家药典标准检测产品的各项指标，如理化性质检测和微生物检测，其中碱-双酶酶解法所分离提取CS产品纯度最高，为94.32％，超出国家药典标准(68％)及出口标准(84.6％)，而且CS产品的其他指标也均符合国家药典标准要求。
6.采用超滤浓缩的方法，分离纯化碱-单酶法及碱-双酶法提取的硫酸软骨素与胶原蛋白，然后测定用不同蛋白酶酶解法分离得到的胶原蛋白的分子量范围及胶原蛋白含量。碱-菠萝蛋白酶酶解法分离得到的蛋白含量为10.56g/L，碱-胰蛋白酶酶解法分离得到的蛋白含量为10.05g/L，碱-碱性蛋白酶酶解法分离得到的蛋白含量为9.02g/L，碱-双酶酶解法分离得到的蛋白含量为9.90 g/L，经Trincine-SDS-PAGE电泳检测，不同酶解法得到的透过液蛋白分子量均小于6000，其中碱-双酶法分离得到的胶原蛋白分子量小于4000。
硫酸软骨素;蛋白酶;催化位点;分离提取;胶原蛋白
北京化工大学
硕士
微生物与生化药学
张鹏
2013
中文
TQ464.7
83
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）