基于λ-Red重组系统构建3-羟基丙酸工程菌
3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid，3-HP)是一种多功能高值化学品。基因工程菌发酵生产3-HP是目前的研究热点。本研究以耐受高浓度甘油的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae DMS2026)为出发菌株，构建基于串联表达载体和λ-Red同源重组技术的工程菌，并对工程菌生产3-HP的能力进行了探索，具体研究内容如下:
1、克隆了K.pneumoniae甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC，构建了由甘油脱水酶自身组成型启动子肚调节的串联表达载体pET-pk-dhaB-puuC，电击转化K.pneumoniae DSM2026，获得重组菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC)，进行微氧摇瓶发酵及上罐发酵。结果:微氧摇瓶发酵15 h后，重组菌的3-HP产量达到最大值7.2 g/L，分别为野生型K.pneumoniae和K.p(pET-pk)的6.79和8.47倍，副产物乳酸和乙酸浓度也为整个发酵周期最低值的0.49 g/L和1.07 g/L;上罐发酵在维持低副产物水平的同时，3-HP产量达到14.2 g/L，因此确定重组菌的最佳发酵周期为15h。
2、克隆了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1，在pET-pk-dhaB-puuC基础上，构建了耦合3-HP生产与NAD+再生的串联表达载体pET-pk-dhaB-puuC-GPD1，对重组菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)进行微氧摇瓶发酵。结果:引入GPD1后，重组菌生物量较K.p(pET-pk-dhaB-puuC)有明显提升，而3-HP最高值降为1.45 g/L，分别为野生型K.pneumoniae和K.p(pET-pk)的1.93倍和2.39倍，乙酸浓度为发酵周期最低值0.54 g/L。
3、克隆了λ-Red同源重组系统所需的重组酶基因beta、gam、exo以及上游启动子序列区，构建重组质粒pET-ParaB-Red，并成功转化K.pneumoniae DMS2026，得到重组菌K.p(pET-ParaB-Red)。L-阿拉伯糖梯度诱导实验表明，在40 mmol/L L-阿拉伯糖诱导90 min后重组酶获得最佳表达量。
将连续三轮易错PCR扩增的副产物基因片段lldD、pta、poxB经三轮电击转化至重组菌K.p(pET-ParaB-Red)，通过高通量筛选获得了两株性状明显的突变菌株K.pneumoniae(32#)和K.pneumoniae(25#)。摇瓶发酵实验结果:K.pneumoniae(32#)的副产物乙酸和乳酸维持在0.4 g/L以下，而3-HP也持续低表达，最高值仅为0.33 g/L。K.pneumoniae(25#)3-HP产量浓度最高达到0.96 g/L;但在副产物生产上，只能较好地控制乳酸水平(＜0.4 g/L)，而乙酸维持在1.5g/L左右波动。此外，测序结果表明，两株菌在核酸及氨基酸水平上都发生了不同变化;连续传代实验表明，两株重组菌的突变均能稳定遗传，没有发生回复突变。
3-羟基丙酸;肺炎克雷伯氏菌;醛脱氢酶;甘油脱水酶;3-磷酸甘油脱氢酶;重组菌;微氧摇瓶发酵
北京化工大学
硕士
微生物与生化药学
田平芳
2013
中文
TQ921.7;TQ920.1
91
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）