基于嗜耐盐菌基因组分析与深海宏基因组文库的酯酶研究
微生物分布广泛，种类繁多，特征各异，蕴藏丰富的基因资源。极端微生物以其独特的生存环境和适应特性引起人们的广泛关注。本论文对太平洋深海海山和高海拔盐湖两个极端环境，通过分别采用宏基因组学和全基因组学的研究方法，从非培养和可培养的角度对极端环境微生物以及他们的功能基因和基因组展开分析，并对宏基因组和全基因组来源的酯酶进行了筛选、克隆、异源表达和酶学性质研究，积累了丰富的酯酶基因资源。
首先，采用太平洋海山区水深5，886m的深海沉积物样品，构建一个fosmid宏基因组文库。该宏基因组文库包括约200，000个克隆，平均插入片段为36kb，整个宏基因组文库包含太平洋海山区深海沉积物中微生物约7，200Mb的基因组DNA，是一个巨大的微生物基因资源宝库。
其次，采用基因组测序和分析的方法对一株分离自中国新疆阿牙克库木盐湖的嗜盐古菌HalobiformalacisalsiAJ5T进行研究，显示该菌株的基因组由一个环状染色体和两个质粒构成。H.lacisalsiAJ5T基因组中编码有脂肪酶、视紫红质蛋白、α-淀粉酶和聚羟基脂肪酸酯合成酶等具有很高工业应用价值的酶。H.lacisalsiAJ5T的基因组中存在大量与DNA修复机制相关的基因以适应高紫外辐射的生存环境，其蛋白质等电点(pI)值的分布呈现偏酸性，从蛋白质组水平上体现了其对高盐环境的适应。
然后，基于酶活性的筛选方法，从所构建的深海沉积物宏基因组文库中获得24个酯酶阳性克隆，并通过亚克隆或质粒全测序的方法得到10个酯酶基因序列。采用全基因组分析的方法从海洋细菌PelagibacteriumhalotoleransB2T中获得13个疑似酯酶基因。这些新型酯酶基因为今后的研究提供了材料。
最后，对筛选出来的2个酯酶Est6和PE10进行了克隆、异源表达、亲和纯化以及酶学性质的研究。结果表明Est6最适催化底物为对硝基苯酚丁酸酯，最适反应条件为20℃和pH7.5，对Mn2+有着较强耐受性，属于低温酯酶，具有潜在的应用价值。PE10的最适催化底物为对硝基苯酚乙酸酯，最适催化条件为45℃，pH7.5，对NaCl、DMSO、甲醇等表现出了较强耐受性。同源建模显示PE10蛋白质表面具有高的负电势，这与其对高盐环境的适应相关。由于对有机溶剂和高盐的适应性，因此PE10是一个很好的工业应用候选酯酶。
脂类水解酶;宏基因组学;极端微生物;嗜盐古菌;基因组测序
浙江大学
博士
微生物学
吴敏
2013
中文
Q55
133
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）