环介导等温扩增技术快速检测转crylA基因抗虫水稻、棉花的研究
自上世纪80年代以来，转基因技术经历了迅猛的发展，给人们带来了很大的便利，现在已有许多的转基因作物进入了我们的日常生活。转基因作物具有产量高、抗逆性好、品质优良等特点，但关于转基因食品的安全性、生态安全等问题也一直备受关注。许多国家已经出台了相应的法律法规对转基因作物及其衍生产品进行标识管理，因此这就迫切需要合适的检测手段对转基因食品进行监控。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本荣研株式会发明的一种核酸扩增技术，与PCR技术相比具有操作简单、快速、特异性高、成本低等优点。它是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件65℃左右下进行扩增，可在1h内将靶基因片段扩增109～1010倍，因而具有很高的灵敏度和特异性。
本论文建立了用环介导等温扩增法检测转cry1A基因抗虫水稻和抗虫棉花的方法。本研究根据郭三堆专利中转基因植物(专利申请号95119563.8，公开号为CN1134981A)所应用的人工合成的杀虫蛋白质融合基因（cry1A基因）序列，利用LAMP引物在线设计软件设计引物，并对镁离子浓度、dNTPs浓度、反应温度、内外引物比、Bst DNA聚合酶浓度等条件进行优化，建立LAMP检测转基因水稻和转基因棉花的最佳反应体系。
LAMP检测转基因水稻25μL反应体系如下:LAMP反应上、下游外引物F3、B3浓度均为0.5 mmol/L;上、下游内引物FIP、BIP浓度均为3.0 mmol/L;其他反应组分终浓度分别为:2.5μL Bst DNA聚合酶缓冲液(20 mM Tris-HC1(pH8.8，25℃)，10mM KCl,10 mM(NH4)2SO4,2 mM MgSO4,0.1％ Triton X-100），Mg2+浓度0.5mmol/L，dNTPs浓度为6.0 mmol/L，8 UBst DNA聚合酶大片段的添加量为0.7μL，模板DNA浓度为50 ng/μL;反应条件为65℃恒温反应60 min，80℃2 min使酶灭活。检测转基因棉花的LAMP25μL反应体系为:Mg2+浓度为1.0 mmol/L，dNTPs浓度为5.0 mmol/L，其它与检测水稻的反应体系及反应条件一致。LAMP反应产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果，产生预期的梯形条带。
采用CTAB法制备DNA模板进行PCR和LAMP反应，其方法的检出限分别为0.1％和0.01％，LAMP方法的检出限是PCR的10倍。另外，对3种非转基因水稻、3种棉花、2种非转基因大豆、2种非转基因番茄及3种含cry1Ac基因的阳性Bt菌株分别进行了PCR反应和LAMP反应来验证引物的特异性，PCR和LAMP反应结果是一致的，转基因棉花鲁棉17为阳性，其他两种非转基因棉花也为阳性，可能是在田间以被污染，其他样品均为阴性结果，说明建立的LAMP方法具有很好的特异性。
LAMP扩增反应可在60 min内完成，对转基因水稻和转基因棉花检测的整个过程(包括DNA提取60 min、LAMP反应60min和电泳30 min)可在2.5 h内完成，比传统PCR检测方法时间缩短一倍，且仪器要求简单。如在LAMP反应结束后在反应管中加入SYBR GreenⅠ荧光染料，通过混合液的颜色可直接判断扩增是否发生，整个检测可在2h内完成，建立了转基因水稻和转基因棉花的LAMP检测方法。
总之，本研究建立的LAMP检测抗虫转cry1A水稻、棉花技术，具有灵敏度高、特异性好、耗时短、鉴定简便等优点，有着广泛的应用前景。该检测方法为转基因作物快速检测构建了良好的技术平台，同时为下一步制定相关的国家标准和行业标准奠定了基础。
转基因水稻;转基因棉花;环介导等温扩增检测;crylA基因;标识管理
河北农业大学
硕士
微生物学
檀建新
2013
中文
S5-33;S511.035.3;S562.035.3
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2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）