农杆菌介导的小麦成熟胚转化体系的优化及TaATG8的遗传转化
小麦是我国主要的粮食作物之一，是人类重要的植物蛋白质摄取来源，在食品工业和农业生产中占重要地位。小麦品种的遗传改良一直受到广泛的重视。由于传统的育种方式难以满足现代社会中人们对小麦产量和品质的需求，加上病虫害等一些不利因素的影响，常造成小麦产量的大幅度下降和品质降低。应用生物技术手段改良小麦品种以提高其抗病虫能力、品质、产量越来越受到人们的重视。因此，建立高效稳定的组织培养体系提高小麦遗传转化效率将为分子育种奠定基础。
目前，在农杆菌介导的小麦成熟胚转化体系中，存在愈伤组织分化再生率低，导致转化率较低的问题，因此建立优良的农杆菌介导的小麦成熟胚再生体系是非常必要的。本研究以小麦品种5389为受体材料，通过摸索不同培养基、2，4-D对胚性愈伤组织形成的影响，抗氧化剂浓度、外植体苗龄、激素配比、共培养时间及抑菌剂对愈伤组织分化的影响，优化了小麦成熟胚转化体系。
自噬(Autophagy)是细胞在营养缺乏或应激条件下，通过降解细胞内衰老的长寿命蛋白质、受损伤的细胞结构和细胞器，为细胞的重建、再生和修复提供必需原料，实现细胞的再循环和再利用，是生物体内一种重要的防御和保护机制。本课题组最近的工作表明，在小麦与叶锈菌组成的亲和和不亲和互作体系中，自噬相关基因TaATG8在转录水平和翻译水平的表达都存在明显差异，暗示着TaATG8可能与小麦抗叶锈菌侵染有关。本研究构建了小麦TaATG8基因的超表达和RNAi植物双元表达载体，转入根癌农杆菌菌株EHA105中，并利用优化的农杆菌介导的小麦成熟胚转化体系进行遗传转化，以期为进一步研究TaATG8在小麦抗叶锈菌侵染过程中的作用及作用机制奠定基础。本研究主要获得以下结果:
1.小麦品种5389诱导胚性愈伤组织的2，4-D适宜浓度为2 mg·L-1，所选培养基为MS培养基。
2.适宜小麦遗传转化的愈伤组织诱导培养时间为20 d，抗氧化剂维生素C浓度为2 mg·L-1，共培养时间为3d，最佳激素配比为:玉米素ZT1.0 mg·L-1、BA0.5 mg·L-1和IAA0.5 mg·L-1，在抑菌剂特美汀(Timentin)为100 mg·L-1、头孢霉素(Cef)为200mg·L-1时能够有效抑制农杆菌生长且能明显提高愈伤抗性和丛生芽再生率。
3.分别经DNA-PCR和RT-PCR验证，确定获得转化GUS基因阳性植株。
4.利用去除终止子的TaATG8片段与GFP融合后构建植物表达载体，通过注射烟草进行瞬时表达，通过激光共聚焦显微镜观察发现TaATG8在胞质中表达。
5.分别构建了TaATG8的超表达和RNAi载体，并利用优化的小麦成熟胚转化体系对5389进行了TaATG8基因的遗传转化，对洛夫林10进行了TaATG8基因的RNAi载体的转化，均获得PCR阳性植株。
小麦;成熟胚;遗传转化;TaATG8基因表达;绿色荧光蛋白;抗叶锈菌侵染
河北农业大学
硕士
植物学
韩胜芳;王冬梅
2013
中文
S512.103.53
56
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）