小麦与叶锈菌互作过程中CaMa靶蛋白TaCAMTA4基因的克隆及表达分析
Ca2+/CaM信号转导系统已被证实在小麦抵抗叶锈菌侵染的防卫反应中具有重要作用。为丰富对该信号转导系统的研究，以TaCaM4-1为诱饵进行的酵母双杂交试验在受叶锈菌侵染的小麦叶片cDNA文库中筛选出7个CaM结合蛋白阳性克隆基因，其中包括TaCAMTA4基因。本试验是在酵母双杂交试验的基础上进行的。CAMTA（calmodulin-binding transcription activator，钙调素结合的转录激活子）基因家族是一类具有CaM（calmodulin，钙调素）结合活性的转录因子家族，其具有四个典型的保守结构域，即CG-1结构域、TIG结构域、ANK repeat结构域及CaM结合结构域。研究发现，CAMTA在植物生长发育和抵抗逆境胁迫（如病原菌侵染、植物激素、冷、热及干旱等）过程中起到重要作用。本试验以TaCAMTA4基因为研究对象，进行了如下试验并获得相应试验结果:
(1)通过一对一酵母共转化试验将7个阳性克隆基因分别与诱饵质粒共转化酵母细胞通过检测报告基因的表达进一步验证了7个阳性克隆。
(2)利用5'-RACE PCR扩增TaCAMTA4基因5'端未知序列并通过序列拼接获得TaCAMTA4基因cDNA全长2704bp。
(3)利用生物信息学分析TaCAMTA4保守结构域，通过同源比对确定该基因为CAMTA家族成员，并通过与拟南芥中6个AtCAMTA基因的同源比对对该基因正式命名为TaCAMTA4。
(4)利用双分子荧光互补试验在烟草细胞中验证了TaCAMTA4蛋白与TaCaM4-1可在细胞质及细胞核中发生相互作用。
(5)电泳迁移率变动分析证实，该蛋白与TaCaM4-1的互作位点位于C-端。
(6)构建了TaCAMTA4基因DNA结合区的原核表达载体pET28a-CG-1，并确定了其在大肠杆菌原核表达菌株BL21中的最佳诱导条件。
(7)通过实时定量PCR方法检测了亲和组合与不亲和组合中该基因在小麦受叶锈菌侵染后不同时间点的表达量。结果显示，在不亲和组合中，在侵染后4h，TaCAMTA4表达量即出现下降趋势并随时间点逐渐降低，在8h降至最低，约为初始水平的一半，从24h起表达量逐渐恢复，直至48h恢复至初始水平;在亲和组合中，TaCAMTA4的表达量有微弱的下降趋势，其变化趋势相较不亲和组合不明显。初步推断TaCAMTA4在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中可能起负调控作用。
上述结果对进一步研究TaCAMTA4基因在小麦抵抗叶锈菌侵染的防卫反应中的作用、完善小麦抵抗叶锈菌侵染的Ca2+-CaM信号转导机制具有重要意义。
小麦;叶锈菌;钙调素结合蛋白;CAMTA基因表达;双分子荧光互补;抗病性
河北农业大学
硕士
细胞生物学
王冬梅
2013
中文
S512.103.4
48
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）