大豆抗SMV侵染过程中RT-qPCR内参基因的筛选及胼胝质代谢相关基因的表达分析
实时定量PCR(real time quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析。大多数传统内参基因已不能满足RT-qPCR准确定量的要求。本研究分析了在四种不同逆境条件下大豆中9个内参基因ACT11、TUA5、CYP、EF1B、TUA4、TUB4、EF1A、ACT27和UKN2的表达稳定性。结果表明:EF1A和ACT11在盐胁迫下表达稳定;TUB4、TUA5和EF1A在干旱处理时表达稳定;ACT11和UKN2在黑暗(衰老)处理时表达稳定;EF1B和UKN2在受大豆花叶病毒侵染时表达稳定;四种胁迫条件下EF1B和UKN2是大豆中比较稳定表达的内参基因。
本实验室前期工作已经证明,在大豆-大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)组成的不亲和组合中胼胝质在胞间连丝(PD)上的沉积是阻碍病毒进行胞间转运的关键。在此基础上,利用冀豆7号与大豆病毒株系Sc-8和N3分别组成亲和组合和不亲和组合,以前面筛选得到的病毒侵染时表达稳定的EF1B和UKN2作为内参基因,于接种后不同时间点对参与大豆胼胝质代谢的2个β-1,3-葡聚糖(β-1,3-glucanase,BG)基因和10个胼胝质合酶(Callose synthase,Ca1S)基因的相对表达量进行分析。结果表明β-1,3-葡聚糖酶基因B1和B2在亲和及不亲和组合中接种病毒后均被诱导表达。胼胝质合酶中C7在亲和及不亲和组合中的表达差异明显,其中亲和组合表达量随接种进程基本不变,但在不亲和组合中在接种后8h即开始上调,到接种后144h达对照的54.5倍;C11,C12在两种组合表达趋势相似,在侵染早期(接种后0~12 h)略呈下降趋势,到侵染后期即接种后96 h,不亲和组合表达量开始升高,而亲和组合在接种后96 h和144 h表达量恢复并维持在对照水平;C1,C2表达趋势基本相同,在亲和及不亲和组合均上调表达;C3,C5,C9表达量在两种组合中随接种进程基本没有变化;C8和C10在两种组合中随接种进程均呈现下调趋势。
实验室前期对β-1,3-葡聚糖酶及胼胝质合酶的亚细胞定位表明,在不亲和组合中β-1,3-葡聚糖酶被定位在液泡中,而胼胝质合酶定位在胞间连丝上。但在亲和组合中两种酶均被定位在胞间连丝上。因此我们推测,在大豆病毒侵染过程中两个β-1,3-葡聚糖酶虽然在转录水平被诱导,但在不亲和组合中与胞间连丝处胼胝质的积累无关,而在亲和组合中与胞间连丝上胼胝质的水解可能相关;胼胝质合酶中C7可能在不亲和组合中与胼胝质在胞间连丝上的沉积密切相关,C11,C12可能在接种后期参与此过程。C1,C2,C3,C5,C9,C8及C10均可能不参与不亲和组合胞间连丝处胼胝质的积累过程。
大豆花叶病毒;实时定量PCR;内参基因表达;胼胝质合酶;大豆抗逆性
河北农业大学
硕士
细胞生物学
侯春燕;王冬梅
2013
中文
S565.103.4
45
2013-12-31(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)