实时荧光环介导等温扩增技术检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的研究
小肠结肠炎耶尔森氏菌是重要的人畜共患病微生物，能通过食物传播。该菌能够引起多种动物以及人的小肠结肠炎耶尔森氏菌病。正因如此很多国家规定，对于进出口的食品该菌是必检的常规项目。常规的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法操作步骤复杂，并且费时，一般要3～7天，不能达到快速检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的要求。所以建立一种快速、有效的检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法是迫切需要的。
Notomi T.等人在2000年研究开发出一种新的核酸扩增技术——环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）。本研究中所用的实时荧光LAMP技术可以通过与电脑连接，直接观察反应的进行情况，不需要经过繁琐的凝胶电泳观察结果。
本研究选择的靶基因是小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因，利用在线引物设计软件设计并选择了一对特异性引物，利用实时荧光监测仪62℃保温反应60min对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测。最终确定的实时荧光LAMP反应体系为:反应内引物FIP和BIP各3μmol/L，反应内引物F3和B3各0.5μmol/L，其它反应组分分别为:2.5μLdNTPs，0.5 mM MgSO4，2μL10×Bst酶缓冲液，1μLBstDNA大分子聚合酶，1μL模板DNA，甜菜碱1 mmol/L，荧光染料0.5μL，纯水补足体积到25μL。
本研究以小肠结肠炎耶尔森氏菌和其他非小肠结肠炎耶尔森氏菌作为试验用菌株进行实时荧光LAMP的检测，通过对引物特异性进行验证，发现阳性结果均为小肠结肠炎耶尔森氏菌株，而其他的非小肠结肠炎耶尔森氏菌株结果均显示为阴性，由此说明试验所设计的引物特异性良好。从人工污染的鸡肉中，采用3种方法进行DNA模板的提取，并对其进行比较，结果表明模板的提取方法对反应的影响并不大，即实时荧光LAMP对模板的制备方法要求并不高。本研究还对反应的灵敏度进行了研究，结果表明，对小肠结肠炎耶尔森氏菌纯培养物的检测灵敏度可以达到61CFU/mL，与PCR的方法比较，其灵敏度高出10倍。对人工污染样品的检出限可以达到46CFU/mL。
本研究所建立的实时荧光LAMP方法能够直接对样品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测，大约1h即可完成，与传统培养方法相比，实时荧光LAMP法用时短，且操作简单。
小肠结肠炎;耶尔森氏菌检测;ail基因;实时荧光监测仪;环介导等温扩增;食品检验
河北农业大学
硕士
食品工程
张伟
2013
中文
TS207.4
57
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）