抗猪2型圆环病毒融合基因的优化及其抗病毒效果检测
猪2型圆环病毒(PCV2)是猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体。该病毒还与增生性或坏死性肺炎(PNP)、新生仔猪先天性震颤(CT-AII)、猪皮炎肾炎综合征(PNDS)、繁殖障碍、肠炎等疾病的发生有重要关联。猪2型圆环病毒已成为一种对养猪业有严重影响的病毒，给养猪业带来了巨大的经济损失。
衣壳蛋白靶向灭活(CTVI)策略是近年来兴起的以蛋白为基础的抗病毒策略，其基本原理为在病毒复制的过程中，将某些核酸酶引入病毒内部，降解病毒基因组，从而达到灭活病毒的目的。其与基于核酸水平的抗病毒策略（如反义核酸，RNAi，核酶等）相比，具有稳定性高、特异性好、不产生突变株等优点。这种策略为研究抗PCV2病毒基因的筛选提供了新的思路。
本实验室在以前的研究中，构建了以pIRESneo载体为骨架的JNPC（金黄色葡萄球菌核酸酶置于PCV2核衣壳蛋白氨基端）、PNJC（金黄色葡萄球菌核酸酶置于PCV2核衣壳蛋白氨基端）基因、cap基因真核表达载体，并通过细胞转染，获得了稳定表达JNPC、PNJC两种融合蛋白的转基因细胞系。通过PCR的方法，鉴定细胞系基因组上是否有外源基因的整合;通过RT-PCR、Northern杂交，鉴定转基因细胞系的转录产物;通过蛋白免疫印迹、核酸酶活性检测，分析细胞系表达的融合蛋白。最后对两种细胞系进行了抗病毒效果检测，发现JNPC融合基因结构具有较好的抗病毒效果，但是，该融合基因结构的抗病毒效果还不是很理想。分析其原因可能为(1)密码子的偏好性;(2)存在异常拼接位点，这一点通过前期的RT-PCR，克隆测序等实验得到了证实。因此要获得抗病毒效果更为理想的融合基因结构，需要进一步改造载体结构，对SN与PCV2衣壳蛋白融合蛋白基因编码序列(JNPC)进行重新设计合成。
本研究主要通过对JNPC进行重新设计合成以及对载体pIRESNeo进行改造（去掉质粒pIRESNeo中的人工内含子），构建了新的真核表达载体，获得了稳定表达融合蛋白的转基因细胞系，并对融合基因的抗病毒能力进行了检测。
试验以pattb-INS-CUBC-IRES-Neo-GHPA载体为骨架构建了JNPC基因、cap基因真核表达载体，通过细胞转染的方法，将上述质粒转入PK15细胞中，通过筛选获得了稳定表达JNPC、cap基因的转基因细胞系。我们通过PCR和RT-PCR，来鉴定转基因细胞系，通过融合蛋白核酸酶活性检测实验来检测蛋白表达产物的核酸酶活性。结果显示外源基因整合到了转基因细胞系的基因组中，异常拼接现象消失，融合蛋白在细胞中有表达，而且表达的融合蛋白核酸酶活性较好。
对JNPC、cap、空载体转基因细胞系及未做转染的PK15细胞进行攻毒实验，采用半定量PCR法和荧光定量PCR法对各个样品中圆环Ⅱ型病毒DNA含量进行检测，分析各细胞系的抗病毒效果。分析结果显示，病毒传递到第7代以后，JNPC转基因细胞系中病毒滴度数几乎下降至零，而其他几组细胞间病毒的滴度数无明显差异。这一结果证明了我们通过对JNPC基因的设计合成以及对载体的改造，获得了比以前更有效的抗病毒基因。这使得培育抗PCV2转基因猪成为可能。
衣壳蛋白靶向灭活;猪2型圆环病毒;载体改造;基因合成;抗病毒效果;转基因细胞系
河北农业大学
硕士
动物遗传育种与繁殖
樊宝良
2013
中文
S858.28;S852.651
65
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）