一种利用线粒体DNA鉴别羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的PCR检测方法
近年来随着市场对羊肉的需求逐渐增加，羊肉的造假现象屡禁不止，不仅扰乱了经济秩序，而且危害人们身体健康。市场上尤以猪肉、鸡肉、鸭肉冒充绵羊肉的现象为多。但是现阶段我国对羊肉的制作加工没有任何标准可循，因此，要想打击假羊肉的制作销售，首先要制定统一的检测方法。
本研究的目的是建立一种能够一次性的快速区分出绵羊肉中掺入的猪、鸡、鸭成分的多重PCR检测方法。动物的线粒体DNA具有分子量小、结构保守、热稳定性好、不易降解的结构特点和母系遗传、拷贝数多、进化速度快、不发生重组的遗传特点，对线粒体DNA的序列分析所提供的信息已广泛应用于研究物种之间和物种内部的系统进化分析、动物源性成分鉴定等领域。
应用NCBI的在线BLAST程序、DNAMAN等软件分析线粒体DNA的保守区域和多变区域，用Oligo6.0、Primer5.0等设计引物，对所设计的30余对引物逐一进行试验，最终在线粒体DNA上确定了4对引物。每一对引物分别针对一种动物，能够检出4个物种的各自的特异性的线粒体DNA片段，4对引物扩增出来的片段长度有明显的差异，能在电泳检测中区分出来，同时这4对引物退火温度大致相同、对反应体系的要求差别不大（Mg2+浓度对该反应影响不大），实现了一次多重PCR反应能够扩增出4种目的条带。通过全面的试验，排除了4对引物和4种物种之间发生相互干扰的可能性，保证了多重PCR反应的准确性。最终确定了多重PCR方法的体系和条件。
本研究建立的检测方法的步骤是:(1)用组织基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA。(2) PCR扩增。(3)电泳检测扩增产物，与DNA Marker或标准样品的扩增产物对照确定待测样品成分。
为了确认该检测方法的实际应用价值，必须估测其灵敏性、准确性。将基因组DNA稀释1000倍后，用该方法仍能检测出待测肉样。待测肉样的基因组DNA与其他物种的DNA混合后，检测的灵敏性不受影响。用玉米粉和鱼肉模拟实际应用时遇到的植物性或动物性杂质，在提取DNA时加入玉米粉或鱼肉，灵敏性可达到1/100。样品经高温处理后，基因组DNA大量降解，线粒体DNA能较完好的保存下来，但灵敏性仍有所降低。用试剂盒提取DNA时，消化时间越长，得到的DNA越多，检测结果的准确性越好，但耗时越长。最后用多种肉组织样品的混合物的多次重复试验验证了本方法的稳定性和可靠性。
本方法已申报专利，国家发明专利申请受理号:201310123666.1
多重PCRR检测;动物源性成分;羊肉鉴别;饲料成分;线粒体DNA;序列分析
河北农业大学
硕士
动物遗传育种与繁殖
张英杰
2013
中文
TS207.3;TS251.5
95
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）