绵羊CTSB基因克隆及其活性与卵母细胞发育能力相关性研究
组织蛋白酶B(CTSB)是重要的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在多种生理及病理活动中发挥作用，对动物的卵母细胞成熟及胚胎发育能力有着重要影响。研究绵羊卵母细胞在体外成熟过程中CTSB活性的变化规律及其与卵母细胞发育能力的相关性，可为提高绵羊体外胚胎生产效率提供理论依据和技术措施。
本研究克隆得到了绵羊CTSB基因的CDS序列，全长1008bp，编码335个氨基酸，已提交至Genbank（登录号:KC699918）。利用多种生物信息学软件预测绵羊CTSB蛋白质具有典型的木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶的结构特征，由信号肽、前体肽及成熟肽构成，具有Cys108、His278和Asn298三个半胱氨酸蛋白酶活性位点，以及CTSB蛋白特有的闭合环(occludingloop)结构，并存在翻译后磷酸化及糖基化修饰。
利用荧光底物法使用酶标仪检测绵羊卵丘卵母细胞复合体(COCs)在体外成熟过程中CTSB活性变化规律，结果表明:绵羊COCs中CTSB活性随着体外成熟时间的延长呈逐渐下降趋势，成年绵羊中，与IVM0h时COCs中CTSB活性相对荧光单位(RFU)比值(1.0000)相比较，IVM8h时降至0.7740(P＜0.05)，IVM16h降至0.7030(P＜0.01)，IVM24h降至0.3709(P＜0.01)。羔绵羊中，与IVM0hRFU比值(1.0228)相比较，IVM8h(1.0267)未有显著变化(P＞0.05)，IVM16h降至0.7817(P＜0.01)，IVM24h降至0.6087(P＜0.01)。IVM8h及IVM24h羔绵羊COCs中CTSB活性显著高于成年绵羊。使用激光扫描共聚焦显微镜检测成年绵羊卵母细胞及卵丘细胞中CTSB活性光密度平均值，结果显示IVM24h的卵母细胞中CTSB活性(0.0046)极显著低于IVM0h(0.0119)(P＜0.01)，卵丘细胞中CTSB活性(0.2175)则显著低于IVM0h(0.2960)(P＜0.05);质量差的COCs经体外成熟24h之后，卵母细胞及其卵丘细胞中CTSB活性光密度平均值（0.0439和0.4371）均极显著提高于正常质量组(P＜0.01)。
在成熟液中添加不同浓度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64，研究其抑制CTSB活性及其与卵母细胞发育能力相关性的结果表明:成年绵羊1μmol/LE-64组在IVM8h时COCs中CTSB活性显著低于对照组(P＜0.05)，5μmol/L及10mol/LE-64组则极显著低于对照组(P＜0.01)，IVM16h各试验组均极显著低于对照组(P＜0.01)，IVM24h均显著低于对照组(P＜0.05)，羔绵羊5μmol/LE-64组各时间点CTSB活性均极显著低于对照组(P＜0.01);成年绵羊COCs在含有1，5，10μmol/LE-64的成熟液中经24h体外成熟，E-64各浓度组卵母细胞中CTSB活性较对照组并未显著降低(P＞0.05)，但卵丘细胞中CTSB活性则显著降低(P＜0.05);1，5，10μmol/LE-64对成年绵羊卵母细胞成熟率及卵裂率无显著影响(P＞0.05)，但使囊胚率较对照组提高39.8％～48.6％。
绵羊;酶活性;组织蛋白酶B;卵母细胞;发育能力
河北农业大学
硕士
动物遗传育种与繁殖
田树军
2013
中文
S814.8;S826
72
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）