山羊pcnp基因启动子克隆与结构分析
PCNP是定位于细胞核的一类富含PEST的蛋白。PCNP蛋白与细胞周期相关，但尚不清楚PCNP蛋白的具体功能，研究发现PCNP的过表达能显著促进小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞生长，PCNP可能参与了肌细胞的周期调控，对肌细胞生长有调控作用，并能够影响肌细胞功能。PCNP表达量还与类风湿关节炎发病及病情轻重有关联。在通过DDRT-PCR方法查找与山羊高繁殖力相关的新基因的研究中，发现了pcnp基因的表达量存在差异。这些发现都与pcnp基因的表达量有关，然而迄今为止，pcnp基因表达的相应调控机制并不清楚。
为探索pcnp基因的转录调控机制，本研究从山羊DNA中克隆到pcnp基因的启动子序列，并利用在线软件初步分析了它的结构与功能，预测其核心调控区。构建含该序列的荧光素酶报告基因载体，并通过检测在293T、HeLa及Raw264.7细胞内的荧光素酶活性，以此来证明荧光素酶报告基因重组载体构建的有效性及目的序列的启动子活性。构建含山羊pcnp基因启动子5'递减片段的荧光素酶报告基因7个重组载体，瞬时转染293T、HeLa及Raw264.7细胞后检测荧光素酶活性，筛查pcnp基因的核心启动子区，初步探讨pcnp基因表达的转录调控特点并分析其特异性转录位点。比对11只山羊pcnp基因启动子区，查找可能的变异位点。
成功克隆到山羊pcnp基因启动子片段，长度为1541bp，GenBank登录号为KC261874.1。所得序列与GenBank数据库中牛基因组比对，所得序列前911bp的相似性为94％，后596bp的相似性为95％。经生物信息学分析，山羊pcnp基因的启动子为典型的无TATAbox的启动子，自翻译起始位点前400bp至第一外显子区共545bp为CpG岛，预测翻译起始位点至其上游的200bp左右长度的区域为启动子核心区。
成功构建含该片段的报告基因重组载体，经验证所得序列具启动子转录活性。成功构建7个含山羊pcnp基因启动子5'递减片段的报告基因载体。调控pcnp基因表达的启动子主要正向调控片段推测是-556～-385，在-907～-556之间可能有抑制性DNA元件，在-1435～-907之间和-385～-297之间可能有特异性启动子调控序列，核心启动子区为-297～+104。山羊pcnp启动子对293T细胞具有特异性地高转录活性。
测序比对发现4个变异位点，分别为-1153A/C、-827G/A、-614C/T、-183G/A。其中-1153A/C产生转录因子CDPCR→Nkx2的变异，-183G/A产生转录因子SP1→AML-1a的变异。
山羊;PCNP基因;启动子;荧光素酶
河北农业大学
硕士
遗传学
贾青
2013
中文
Q959.842
60
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）