基于PEDV S重组蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与单克隆抗体的制备
猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的，以猪呕吐、严重腹泻脱水为主要临床症状特征的高度接触性传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪死亡率达95％以上。近年来，PED的流行区域有逐渐扩大的趋势，危害严重，给养猪业带来巨大的经济损失。因此，PED的及时确诊和防治研究具有重要的意义。
根据GenBank中已经发表的猪流行性腹泻病毒毒株的S基因序列并参照PMD19-T载体图谱，设计了1对分别插入限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物，采用PCR技术从猪流行性腹泻病毒HB/FN株中扩增得到一条1080bp的S基因片段。将其连入pMD19-T载体中，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经酶切鉴定筛选出阳性克隆后进行测序，测序结果和GenBank上发表的S基因的核苷酸序列同源性达94％以上。
根据抗原性分析选择其抗原性较高的S基因片段，设计特异性引物，经PCR扩增得到655bp的基因片段，将此基因片段亚克隆插入到原核表达载体pET-28a(+)中，构建了原核表达质粒pET-28a(+)-SFN，将重组质粒转化到表达菌株E.coliBL21(DE3)中，经IPTG诱导后用SDS-PAGE分析，结果显示S重组蛋白的分子质量约为25ku，与预计的蛋白分子量一致。利用His标签的特性对S重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析显示纯化效果好，无杂带。Western-blot试验证明，纯化的S重组蛋白可以与PEDV阳性血清产生特异性结合反应，证明该蛋白抗原性好。
利用纯化的S重组蛋白作为包被抗原，通过各步反应条件的优化，最终确定了检测PEDV抗体的重组S蛋白间接ELISA方法最佳反应条件:抗原经4℃包被过夜;用封闭液(含5％新生牛血清的PBST)37℃封闭1h;待检血清（用封闭液做1∶100倍稀释）100μL于37℃反应1h;酶标二抗（用封闭液做1∶1000倍稀释）100μL于37℃反应45min;加入底物后避光显色15min;加入终止液50μL后测定OD450nm。该方法与TGEV、CSFV、PRV、PRRSV等阳性血清不发生交叉反应，重复性试验结果显示，变异系数均值都小于10％，表明本方法具有较好的特异性和重复性。
用纯化的PEDV重组HIS标签S蛋白做为免疫原，按常规方法免疫BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，制备单克隆抗体(McAb)。经细胞融合获得1株可稳定分泌特异性McAb的抗PEDVS蛋白的杂交瘤细胞，命名为1F2。杂交瘤上清与S蛋白抗原包被的ELISA反应为阳性。Westernblotting试验证明，1F2可以与PEDVS蛋白产生特异性反应，为胶体金免疫层析试纸条的制备奠定了物质基础。
PEDV S基因;原核表达;单克隆抗体;猪流行性腹泻
河北农业大学
硕士
预防兽医学
范京惠;左玉柱
2013
中文
S858.28;S855.3
66
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）