马铃薯早疫病的分子检测及田间早期诊断
茄链格孢离体条件下不易产孢，很难利用传统的形态学方法进行病原菌检测;同时，马铃薯早疫病早期症状的田间观察非常困难。本研究在对病原菌基因组序列分析的基础上，开发出一对PCR引物，利用PCR技术，建立了能够检测马铃薯早疫病菌，进而诊断早期田间病害的分子生物学技术。利用该技术，可以快速、准确、灵敏地检测到马铃薯早疫病菌，并能够在病害发生初期对病害进行监测。因此，建立马铃薯早疫病的早期诊断技术对制定病害防控措施具有重要意义。主要研究结果如下:
1.建立了对马铃薯早疫病菌特异的PCR检测技术。通过对链格孢属核糖体基因内转录间隔区(ITS)的序列同源性分析，设计出一对检测茄链格孢的特异性PCR引物ptAs-F:5'-CACCTCCCGGGGTGGCCA-3'和ptAs-R:5'-CCCGCAAGGGGAGACAAA-3';并优化了PCR扩增体系，50℃退火30 s，72℃延伸23 s，共35个循环。利用引物对扩增后早疫病菌可获得长度为358 bp的特异条带，而在引起马铃薯真菌和细菌病害的病原菌及相关的链格孢种均未扩增出该条带，表明该引物对对马铃薯早疫病菌具有特异性。该方法的灵敏度在病原菌基因组DNA水平上的最低检测浓度为1.0ng/μL;在病原菌孢子数水平上的最低检测浓度为105个/mL。同时，该方法还可以对早疫病菌的扩散进行检测，随着病斑的扩展，检测到的条带不断增多，条带的亮度也不断增加。
2.建立了田间早期诊断马铃薯早疫病的新方法。采用改进的玻璃珠振荡法提取马铃薯叶片组织中病原菌DNA，利用引物ptAs-F/ptAs-R进行PCR扩增，从得到叶片样品到获得叶片是否被茄链格孢侵染的检测结果，仅需2.5 h。利用该方法，可以从处于潜育期的未显症叶片组织中特异性地检测到马铃薯早疫病菌，为田间病害的早期、快速诊断提供技术支撑。
3.利用上述建立的方法，于2013年4月16日分别对滕州市姜屯镇张寨村常年种植马铃薯的3个不同田块采集的侵染初期和发病复叶上未显症的60片马铃薯叶片进行早疫病发病及潜育情况的检测。早期田块下部叶片病菌侵染率分别为90.3％、61.7％和48.3％，即田块Ⅰ被侵染的程度最高，Ⅱ其次，Ⅲ最轻。相应地，5月3日各田块的后期病叶率依次为91.4％、62.8％和49.6％，病情指数分别为24.8、10.9和7.5，与早期检测结果一致，验证了本研究建立的马铃薯早疫病田间早期诊断方法的准确性、可靠性。
茄链格孢;分子检测;早期诊断;马铃薯;早疫病
河北农业大学
硕士
植物病理学
朱杰华;杨志辉
2013
中文
S435.32
51
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）