胰腺癌5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药相关蛋白筛查及胰腺癌候选免疫原性膜抗原SLP-2和Prohibitin分子生物学功能研究
背景: 胰腺癌是消化系统中恶性程度较高、预后极差的肿瘤，其发生发展机制尚未阐明。实现早期诊断与增强化疗效果，是胰腺癌诊治过程中的重点与难点。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是第一个用于胰腺癌化疗的药物，目前仍然广泛应用、具有一定疗效，5-FU耐药性是限制该药应用的主要困扰。国内外多项对5-FU敏感/耐药的胰腺癌或其他肿瘤细胞株的基因芯片与蛋白质组学筛查，获得了一些差异蛋白，但是重合率并不好，可能与基因芯片探针数及二维凝胶电泳所导致的检测通量不足有关。在早期诊断方面，本实验室前期工作发现了9个胰腺癌免疫相关原性膜抗原，同时已对儿茶酚胺氧位甲基转移酶（Catechol-O-Methyltransferase，COMT）、抗增殖蛋白(prohibitin，PHB)、电压依赖离子通道(Voltage-Dependent Anionchannel，VDAC(l))进行了一定程度的生物功能研究与标志物有效性验证，Stomatin样蛋白2（stomatin like protein 2，SLP-2，Stoml2）等其他候选蛋白的研究还有待继续深入。 目的: 1.验证人胰腺癌细胞系亲本株PaTu8988/-与5-FU耐药株PaTu8988/FU对5-FU的药物敏感性差异。 2.筛查亲本株PaTu8988/-与耐药株PaTu8988/FU的差异表达基因及蛋白。 3.研究SLP-2蛋白在人胰腺癌细胞系中的生物学功能。 4.完善prohibitin蛋白过表达后所发生的细胞功能改变的研究。 材料与方法: 1.应用CCK-8法检测人胰腺癌细胞系亲本株PaTu8988/-与5-FU耐药株PaTu8988/FU对5-FU的IC50差异。 2.应用Annexin V/PI双染法分析亲本株PaTu8988/-与耐药株PaTu8988/FU在5-FU诱导下发生细胞凋亡的差异。 3.应用Affymetrix人全转录组外显子芯片GeneChip(@) Exon1.0 ST Array筛查亲本株PaTu8988/-与耐药株PaTu8988/FU的基因表达差异。 4.应用同位素标记相对和绝对定量技术(Isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ)结合Triple TOFTM 5600高分辨液相色谱质谱联用系统筛查亲本株PaTu8988/-与耐药株PaTu8988/FU的蛋白表达差异。 5.应用qPCR及Western blotting法检测SLP-2在9株人胰腺癌细胞系(Capan-1、Panc-1、MIAPaCa-2、T3M4、AsPC-1、BxPC-3、PaTu8988、Su86.86、SW1990)中的表达水平。 6.构建pIERS2-EGFP(+)-SLP2过表达系统与SLP-2 siRNA抑制系统，分别瞬时过表达或抑制SLP-2蛋白在细胞系MIAPaCa-2与BxPC-3中的表达水平。应用CCK-8法、Transwell法观察并对比干预前后胰腺癌细胞在增殖、迁移与侵袭能力的变化。 7.应用qPCR及Western blotting法检测prohibitin在9株人胰腺癌细胞系(Capan-1、Panc-1、MIAPaCa-2、T3M4、AsPC-1、BxPC-3、PaTu8988、Su86.86、SW1990)中的表达水平。 8.构建pIERS2-EGFP(+)-prohibitin过表达系统，瞬时过表达prohibitin蛋白在细胞系MIAPaCa-2中的表达水平。应用CCK-8法、Transwell法观察并对比干预前后胰腺癌细胞在增殖、迁移与侵袭能力的变化。 结果: 1.CCK-8法耐药敏感性检测测定两株细胞50％抑制浓度IC50，PaTu8988/-IC50=4.49±0.60μ g/ml, PaTu8988/Fu IC50=79.19±21.55μ g/ml，具有显著性差异(p=0.0002)，耐药系数RI=17.64。 2.细胞凋亡分析（Annexin V/PI双染法）提示，在5-FU作用下，亲本株PaTu8988/-较耐药株PaTu8988/Fu更易出现细胞凋亡现象。2500μ g/ml5-FU作用下，亲本株PaTu8988/-凋亡率可达45.47±2.14％，而耐药株PaTu8988/Fu凋亡率只有22.33±2.21％。 3.转录组外显子芯片筛查，发现亲本株PaTu8988/-与5-FU耐药株PaTu8988/FU差异表达mRNA2052条，其中PaTu8988/FU较PaTu8988/-上调(＞2.0)1828条，下调(＜0.5)224条。 4.蛋白质组学筛查，发现亲本株PaTu8988/-与5-FU耐药株PaTu8988/FU差异表达蛋白353个，其中PaTu8988/FU较PaTu8988/-上调(＞1.5)259个，下调(＜0.7)94个。 5.基因芯片筛查与差异蛋白质组学筛查共同筛出PaTu8988/FU较PaTu8988/-差异蛋白69个，上调蛋白ABCD3、MTHFD1L、TP53I3、POLA1、SRGAP1、C5等54个，下调蛋白EPCAM、MCAM等15个。 6.slp-2蛋白在9株人胰腺癌细胞系中均有明确表达，但表达量各有差异。结合qPCR与Western blotting结果在MIAPaCa-2中表达量较低，在BxPC-3中表达量较高，BxPC-3细胞系SLP-2表达量是MIAPaCa-2的3倍(p＜0.005)。 7.在体外水平，pIERS2-EGFP(+)-SLP2过表达质粒转染72小时后，SLP-2蛋白表量可趋近高值，过表达组较对照组SLP-2蛋白表达量调高至近3倍(p＜0.05)，过表达组增殖、迁移、侵袭能力明显提高(p＜0.005，p=0.0001，p＜0.0001);SLP-2 siRNA转染48小时后，SLP-2蛋白表量可趋近低限，抑制组SLP-2蛋白表达量降至对照组的1/2(p＜0.05)，抑制组细胞增殖、迁移、侵袭能力明显降低(p＜0.05，p＜0.0001，p=0.0020)。 8.Prohibitin蛋白在9株人胰腺癌细胞系中均有明确表达，但表达量各有差异。结合qPCR与Western blotting结果在MIAPaCa-2中表达量较低，在SW1990、AsPC-1、BxPC-3中表达量较高，AsPC-1细胞系prohibitin表达量是MIAPaCa-2的2-3倍(p＜0.005)。 9.在体外水平，pIERS2-EGFP(+)-prohibitin过表达质粒转染72小时后，prohibitin蛋白表量可趋近高值，过表达组较对照组prohibitin蛋白表达量调高至近1.5倍(p＜0.005)。过表达组增殖、迁移、侵袭能力明显提高(p＜0.001, p＜0.0001, p=0.0005)。 结论: 1.人胰腺癌细胞系亲本株PaTu8988/-与5-FU耐药株PaTu8988/FU对5-FU药物敏感性存在差异，后续耐药蛋白筛查实验有意义。 2.ABCD3、MTHFD1L、TP53I3、POLA1、SRGAP1、C5等功能蛋白以及EPCAM、MCAM等细胞连接蛋白可能是5-FU的耐药相关蛋白。 3.体外实验结果显示，SLP-2蛋白与胰腺癌细胞的增殖及迁移侵袭能力有关。 4.体外实验结果显示，prohibitin蛋白与胰腺癌细胞的增殖及迁移侵袭能力有关。
胰腺癌;5-氟尿嘧啶;耐药蛋白;免疫原性;Prohibitin分子;生物学功能
中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院
博士
临床医学
赵玉沛;王维斌
2013
中文
R735.9
97
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）