大肠杆菌无细胞体系高通量合成蛋白质的探索性研究
与体内合成蛋白质相比，由于无细胞反应体系的开放性，无细胞体外合成蛋白质的一个潜在的重要优点是蛋白质合成的高通量性。本文从无细胞反应内在效率的提高、基于目标蛋白质线性模板的无细胞反应、DNA凝胶辅助的无细胞反应、无细胞反应器微型化及喷墨打印技术等多个角度研究了无细胞体系如何实现高通量蛋白质的合成。 首先选择了枯草芽孢杆菌木聚糖酶作为目标蛋白，研究如何在大肠杆菌无细胞蛋白合成体系实现功能性高效合成。通过对木聚糖酶基因N’端的信号肽序列的突变，采用过量表达了分子伴侣的大肠杆菌制备无细胞抽提物，构建了高效可溶性合成木聚糖酶的无细胞体系，并且通过在无细胞反应体系中添加表面活性剂Triton X-100制备高活性的成熟木聚糖酶。结合优化无细胞反应条件，无细胞体系中表达的木聚糖酶的活性最终提高了6.1倍。这一组合表达策略成功应用于其它四种具有代表性的重要的工业酶（包括碱性磷酸酶、葡萄糖脱氢酶、青霉素G酰基转移酶以及脂肪酶）的体外无细胞表达，与常规的无细胞蛋白表达结果相比，这四个酶的整体表达的水平均获得了从3.2倍到5.3倍不等的增加。 在无细胞蛋白合成体系中，以线性PCR产物为模板是实现高通量合成蛋白质的一个基本策略。然而，由于无细胞体系中核酸酶的存在，线性模板极易降解，从而导致无细胞表达效率低。本文引入了DNA凝胶技术，将线性目标基因模板交联固定在凝胶内部，从而提高以线性目标基因片段为表达模板时无细胞反应的效率。我们对DNA凝胶的制备方法进行了改进，开发了基于乳液原理的高通量制备直径为微米级DNA凝胶微粒的新技术。基于此DNA凝胶微粒的固相无细胞表达模式下，木聚糖酶表达效率与传统的直接添加DNA模板的液相反应体系相比提高了近十倍，有效提高了以线性DNA片段为表达模板时的无细胞表达效率。在此基础上，进一步考察了两种更为稳定而有效的方法，包括冲击混合与膜过滤技术，最终可得到粒度平均分布仅为3μM的DNA凝胶微粒。 在DNA凝胶微颗粒与无细胞蛋白合成体系的基础上，结合脂质体的制备方法，我们建立了一种高通量制备微米级微型生物反应器的方法。通过我们的方法所获得的“人工细胞”（微型生物反应器）具有磷脂双分子层的外膜结构以及固定了目标基因模板的DNA凝胶内核，中间部分则是用于蛋白合成的无细胞表达体系。该“人工细胞”反应器不仅有助于研究微体系下高效率的无细胞蛋白表达，尤其是膜蛋白的无细胞表达，而且整个系统从结构到功能上都模拟了真正的细胞，因而具有极其重要的合成生物学意义。 最后，研究了商业化打印机作为一种高通量反应技术在高通量分散生物样品中的基本规律和特性，并证明了将喷墨打印技术与无细胞蛋白合成体系相结合，用于无细胞高通量反应及在线制备蛋白芯片的可行性。
无细胞蛋白合成体系;枯草芽孢杆菌木聚糖酶;DNA凝胶;无细胞微型生物反应器;大肠杆菌
浙江大学
博士
生物化工
岑沛霖;徐志南
2012
中文
TQ932
131
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）