用于拆分制备L-薄荷醇的脂肪酶基因克隆和表达
本文从实验室保藏的能有效拆分制备L-薄荷醇的菌株中克隆脂肪酶(Pseudomonas alcaligenes X1和Stenotrophomonas maltophilia X2)，实现其在大肠杆菌中高效表达，并对表达产物进行了酶学性质研究。 分别构建了两个菌种的基因文库，通过平板水解圈法初筛以及气相色谱验证，成功克隆到序列长度分别为1575bp的pal和1518bp的sml，通过氨基酸序列的分析，两酶都包含活性中心GISYG，该酶属于Serine水解酶类型，催化中心包括Ser-Asp-His。通过氨基酸序列对比，构建了进化树及结构分析。 以pET30a(+)为载体，E.coil BL21(DE3)为宿主实现两酶的表达，蛋白大小为51kDa。经优化表达后，两酶的水解p-NPO活力分别达到89000U/L和90600U/L。经镍离子柱亲和纯化后，对两酶进行酶学性质分析，分别考察了酶反应的最适温度、pH、底物特异性以及金属离子对酶的作用。利用重组脂肪酶制备L-薄荷醇实验显示，产物e.e.％均大于99％。本实验为L-薄荷醇制备用脂肪酶提供新的基因和酶序列，为该酶的后期改造以及工业化应用奠定基础。
脂肪酶;基因文库;L-薄荷醇;同源分析;拆分制备;基因克隆
浙江大学
硕士
生物化工
杨立荣
2012
中文
Q786;TQ233
101
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）