木瓜蛋白酶的新型包埋及性能研究
本文采用了三种方法来包埋木瓜蛋白酶，其中修饰-包埋酶结合了酶修饰及包埋两种技术的优点，通过在酶表面接上不饱和键实现了酶与载体的多点连接;紫外引发原位聚合包埋酶采用了紫外引发聚合技术，固定化酶的构象是刚性化的，而冷冻聚合技术得到的冷冻凝胶包埋酶因其相互连通的开放孔结构，催化时显示出较小的传质阻力。文中还分别考察了三种包埋酶的催化性能，分析了温度、pH等因素对包埋酶活性的影响，并在活性、稳定性等方面对它们进行比较。 三种包埋酶的活性收率大小:冷冻凝胶包埋酶(90.3％)＞修饰包埋酶(83.6％)＞紫外引发原位聚合包埋酶(65.2％)在60、70℃贮存10h后的热稳定性:紫外引发原位聚合包埋酶＞修饰包埋酶＞冷冻凝胶包埋酶;在强酸(pH=2.4)、强碱(pH=10.83)的环境中浸泡3h后的pH稳定性:冷冻凝胶包埋酶＞修饰包埋酶＞紫外引发原位聚合包埋酶。冷冻凝胶包埋酶、修饰包埋酶、紫外引发原位聚合包埋酶的表观米氏常数分别为14.9、21.7、45.3mg/mL。通过SEM图片可以看到冷冻凝胶包埋酶有相互连通的开放孔网络结构，孔径（15～50μm）。 修饰-包埋酶的制备:用N-丙烯酰琥珀酰亚胺(NAS)修饰酶分子上的氨基，当木瓜蛋白酶与NAS的摩尔比为1∶28，修饰时间为45min时修饰效果最佳;选取聚乙二醇400二丙烯酸酯作为单体，分别加入四种添加剂半胱氨酸(A1)、牛血清蛋白(A2)、木糖(A3)、椰油酰胺丙基甜菜碱(A4)再加入自由基引发剂引发聚合反应，获得四种修饰-包埋酶。1mL酶液里A1、A2、A3、A4的最适加入量分别为2mmol、1.5μmol、0.03mol、7.5mL。四种包埋酶A1-PA、A2-PA、A3-PA、A4-PA的活性收率分别为83.6％、78.5％、80.1％、82.2％。在强酸(pH=2.4)强碱(pH=10.83)和高温(100℃)中游离酶活性丧失殆尽，A1-PA仍保留初始活性的34.2％、62％、34％。A1-PA的最适温度从40℃上升到60℃。A1-PA循环反应10次后，仍保留56.5％的初始活性。置于4℃下储存60天后，酶活仍为原来的75％。 紫外光引发原位聚合包埋酶的制备:选取聚乙二醇200(400)二（甲基）丙烯酸酯作为单体三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯作为交联剂与酶液混合形成W/O乳化体系，加入引发剂经紫外光照射引发聚合反应得到四种包埋酶。紫外光照时间为1min。活性收率最高的为以聚乙二醇400二丙烯酸酯为单体的包埋酶(Ca-PA)，有65.2％。在强酸(pH=2.4)强碱(pH=10.83)和高温(100℃)中，Ca-PA分别保留初始活性的35.6％、57.9％、34.7％。Ca-PA的最适温度从40℃上升到50℃。Ca-PA循环反应10次后，仍保留83.1％的初始活性。置于4℃下储存60天后，酶活仍为原来的85％。 冷冻凝胶包埋酶的制备:将酶液、单体（丙烯酰胺）、交联剂（聚乙二醇200二丙烯酸酯）、引发剂(H2O2)的混合均一溶液在适宜的低温系统下进行冷冻，再用紫外光照射引发聚合物冷冻晶体进行自由基原位聚合反应，最后得到冷冻凝胶包埋酶。最适冷冻温度为-15℃，交联剂与单体的质量比值为0.6。冷冻凝胶包埋酶(CryogelPA-0.6)的活性收率为90.3％。在强酸(pH=2.4)强碱(pH=10.83)和高温(100℃)中，CryogelPA-0.6分别保留初始活性的46.7％、67.8％、43.5％。最适反应温度都从40℃升到了50℃。CryogelPA-0.6在循环反应10次后，仍保留67.7％的初始活性，4℃储存60天后，酶活仍为原来的77.1％。
木瓜蛋白酶;新型包埋;化学修饰;冷冻凝胶;催化性能
浙江大学
硕士
生物化工
宋锡瑾
2012
中文
Q814
104
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）