ASPP2与p53双基因联合促进结直肠癌细胞凋亡分子机制研究
目的:结直肠癌是严重威胁我国人民健康的最重要恶性肿瘤之一。p53作为重要的抑癌基因在75％以上的散发性结直肠癌患者存在突变，但以p53腺病毒为基础的大肠癌生物治疗仍受到单次使用剂量以及单次治疗时间的限制。因此进一步探讨p53治疗结直肠癌的作用机制和提高疗效的方法成了当务之急。最近研究发现，p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating proteinof p532，ASPP2)能够与野生型p53结合，选择性增强p53的促细胞凋亡活性，但其具体的分子机制仍不清楚。本课题旨在探讨ASPP2对饥饿诱导的大肠癌HCT116 p53++（p53野生型）细胞凋亡、周期和自噬的影响，并深入探讨ASPP2调节ASPP2-p53凋亡通路的相关机制。
方法:第一部分试验:利用ASPP2腺病毒(rAd-ASPP2)感染使细胞过表达ASPP2基因。无血清培养基培养24h诱导凋亡、自噬和细胞周期改变。Calcein/PI吸收试验观察各组细胞调亡水平。细胞转染红色荧光蛋白标记的CFP-Lc3自噬质粒，荧光显微镜下观察各组细胞自噬水平。流式细胞术观察细胞周期改变。第二部分实验:分别利用野生型和非磷酸化突变型ASPP2质粒转染使细胞过表达野生型和非磷酸化突变型ASPP2蛋白。使用化疗药物奥沙利铂诱导细胞发生凋亡。通过annexin(V)-PI双染，流式细胞术检测细胞的凋亡水平。通过免疫共沉淀技术检测野生型和非磷酸化突变型ASPP2与p53蛋白的结合能力。
结果:第一部分:ASPP2过表达显著促进了饥饿诱导的细胞凋亡（GFP+饥饿组10.00％±1.42％; ASPP2+饥饿组18.44％±2.06％ P=0.000）、自噬(GFP+饥饿组35.00％±5.34％; ASPP2+饥饿组57.61％±6.06％ P=0.000）以及G2M期阻滞，但无饥饿诱导时ASPP2过表达使GOG1、G2M期都发生阻滞。第二部分:奥沙利铂诱导了ASPP2蛋白92及361两丝氨酸位点的磷酸化，并且只有野生型的ASPP2能够促进奥沙利铂诱导的HCT116 p53+/+细胞的凋亡。只有野生型的ASPP2能够与p53蛋白发生结合。
结论:1.ASPP2过表达促进饥饿24h诱导的细胞凋亡和自噬，显著改变细胞周期进程。2.奥沙利铂诱导ASPP2蛋白在ser92/ser361两个位点发生磷酸化，并且ASPP2的磷酸化状态在奥沙利铂诱导的结肠癌HCT116细胞的凋亡过程中发挥了关键作用。
p53凋亡刺激蛋白2;结直肠癌;细胞周期;蛋白磷酸化;分子机制
济南大学
硕士
外科学
郭洪亮
2013
中文
R735
48
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）