绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的重组表达及初步活性鉴定
目的:原核表达及纯化绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE并进行初步活性鉴定。
方法:分析绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的基因序列，设计带适当酶切位点的引物，用PCR方法扩增出FlgE的编码DNA序列，与大肠杆菌表达载体pET24a同时经NdeⅠ/HindⅢ双酶切、纯化及连接后构建pET24a-FlgE原核表达质粒，挑选重组阳性质粒经DNA测序确认序列正确，转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达条件优化，使重组质粒表达目的蛋白，采用组氨酸标签亲和层析等法对目的蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE对纯化后蛋白分子量进行鉴定，用试剂盒进行去内毒素化处理。在体外培养人角膜上皮细胞系细胞，加入纯化的FlgE重组蛋白，培养4小时后应用实时定量PCR检测各种相关的炎性因子以反映FlgE蛋白活性。
结果:可用于大肠杆菌表达系统的重组pET24a-FlgE构建成功，其编码的蛋白在BL21中获得高效表达，当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡哺半乳糖苷浓度为1mmol/L，在16℃、225r/m振荡培养20小时时，诱导目的蛋白表达量最高，经纯化、去内毒素处理和SDS-PAGE分子量鉴定，获得纯化的重组FlgE蛋白。角膜上皮细胞用20μg/mL FlgE处理后，细胞内炎性相关分子IL-6和IL-8的表达量明显上升，而灭活的FlgE蛋白则丧失该刺激活性。
结论:获得纯化的重组绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE，且可刺激角膜上皮细胞上调炎性因子IL-6、IL-8的表达。
绿脓杆菌;鞭毛蛋白;原核表达载体;角膜上皮细胞;炎性因子
济南大学
硕士
眼科学
王宜强
2013
中文
R772.2
45
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）