牙本质基质蛋白1的矿化功能研究
牙本质基质蛋白1(Dentin matrix protein1，DMP1)基因位于人类染色体4q21，其编码的蛋白质是一种高度磷酸化的偏酸性非胶原蛋白，由于其拥有较大的酸性结构域，携带大量的负电荷，故与钙离子有较强的结合能力。它在生物体外能够促进羟基磷灰石的形成，并且调控细胞的分化过程;在生物体内能够参与硬组织的矿化过程。DMP1在骨组织与细胞中已被发现主要有4种存在形式，即全长DMP1、37 KD N-DMP1、57 KD C-DMP1和DMP1-PG，它们的分布位置以及功能作用各不相同，但是对于骨的正常形成都具有十分重要的意义。目前国内外对DMP1主要功能片段以及DMP1影响成骨细胞分化机制的研究仍存在争议。因此，本实验分别扩增出37 KD N-末端的DMP1和全长DMP1，分析它们在生物矿化过程中所起的作用。
目的:检测DMP1不同功能片段在胞内定位及含有rs10019009SNP位点不同碱基的DMP1对细胞矿化功能的影响。
方法:利用定点突变改造DMP1基因，获得DMP1基因的SNP rs10019009的不同基因型，利用PCR技术和双酶切定向克隆方法将含有SNP位点不同碱基的37kDa N-DMP1和全长DMP1基因定向克隆入含增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP中，构建重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP，通过脂质体法瞬时转染HEK293细胞，荧光显微镜观察重组融合蛋白DMP1-EGFP的表达及胞内定位。采用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性检测的方法检测SAOS-2细胞前后ALP活性变化，采用茜素红染色法观察SAOS-2矿化结节的形成，从而分析DMP1对SAOS-2细胞矿化功能的影响。
结果:DNA测序结果表明，定点突变后的DMP1基因的碱基序列与设计序列完全一致;PCR和DNA测序显示重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP构建成功，融合蛋白DMP1-EGFP在HEK293细胞中主要表达于细胞的胞浆中。ALP活性检测实验结果表明，DMP1的不同功能片段均能提高SAOS-2细胞的ALP活性，全长的DMP1的重组质粒比N端DMP1的重组质粒的ALP相对活性高，含有rs10019009SNP位点突变的T碱基的DMP1的重组质粒比含有野生型的A碱基的DMP1的重组质粒的ALP活性高。经过抗坏血酸、β-磷酸甘油矿化诱导，通过茜素红染色实验发现含有突变型的T碱基的DMP1重组质粒比含有野生型A碱基的DMP1的重组质粒更能促进矿化结节的生成，全长的的DMP1的重组质粒较N端的DMP1的重组质粒更能促进矿化结节的形成。
结论:已成功构建了含rs10019009SNP位点不同碱基的37kDa的N-DMP1和全长的DMP1基因的重组表达质粒，并在HEK293细胞的胞浆中有效地表达，通过ALP活性检测和茜素红染色检测矿化结节实验含有突变型的T碱基的DMP1比含有野生型A碱基的DMP1更能促进细胞的生物矿化，全长的的DMP1较N端的DMP1更能促进细胞的生物矿化，为进一步研究DMP1对生物矿化的作用以及rs10019009SNP位点通过何种机制来参与强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，AS)发病奠定了基础，也为其今后作为靶点治疗AS提供了实验依据。
牙本质基质蛋白;生物矿化;融合表达;碱性磷酸酶;矿化结节;成骨细胞分化
济南大学
硕士
微生物与生化药学
韩金祥
2013
中文
R780.2;R361.3
67
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）