力竭性运动致延迟性心肌损伤的炎性机制及苦苣提取物的干预作用
目的：
近年来，随着竞技体育的飞速发展和全民健身运动的广泛开展以及生活压力增大，锻炼人数越来越多，运动量日益加大，运动性猝死事件不断发生，其死因85％以上是心源性猝死，且相当一部分猝死出现在运动结束之后。为此，长时间剧烈运动或过度运动对心脏产生不良影响的严重医学问题以及全民应该如何更为健康地运动成为人们日益关注的焦点。本研究在前期研究的基础上，拟观察经一周反复力竭性运动结束后恢复期不同时间点（运动后即刻、3h、6h、12h、24h、48h和96h）大鼠心肌超微结构改变以及大鼠血清和心肌组织中TNF-α、NF-κB、ICAM-1等炎性因子和细胞凋亡的动态变化规律;同时研究苦苣提取物3.2g/kg（按生药计）和1.6g/kg对大鼠力竭性游泳运动后24h和48h心肌组织病理学改变以及血清和心肌组织中TNF-α、NF-κB、ICAM-1等炎性因子和细胞凋亡的影响，以探讨运动延迟性心肌损伤的炎性产生机制和苦苣提取物的干预作用，为预防运动性猝死的发生和运动性心肌损伤的康复治疗提供重要的实验理论依据。
方法：
1.运动延迟性心肌损伤模型的建立采用经典的Thomas的方法通过反复力竭性游泳运动建立延迟性心肌损伤实验动物模型。力竭性游泳运动采用尾部负重2％体重的负荷，每天游泳至力竭状态，连续1周（7天）。力竭标准采用“经过10秒后动物仍不能返回水面为标准”[1]。
2.动物分组及给药将262只健康雄性SD大鼠随机分为安静对照组(SC，35只)、力竭性运动模型组（M，155只）和苦苣提取物治疗组（D，72只）。安静对照组大鼠不进行任何运动直接取材;模型组大鼠进行通过反复力竭性游泳运动。运动模型组根据运动后恢复时间不同又分为运动后即刻组(st)、3h组、6h组、12h组、24h组、48h组和96h组（每组分别为20、17、17、17、17、35、35、17只），运动结束后按不同时间点取材;苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg给药组又各自分为给药24h组和48h组（每组18只）。苦苣提取物给药24h组分别于运动后即刻和运动后23h给药一次，末次给药后1h取材;给药48h组分别于运动后即刻、24h、47h给药1次，于末次给药后1h取材。
3.取材及观察指标①各组大鼠分别于运动结束后相应时间点观察大鼠身体的一般状况并称体重(Body weight，BW)，计算体重变化百分率。
②各组大鼠分别自颈静脉窦取血2ml，制备血清，-20℃保存备用，采用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测大鼠血清中TNF-α、NF-κ B和ICAM-1含量以及cTnI含量，全自动生化分析仪检测血清中心肌酶谱CK、CK-MB含量。
③处死动物，迅速取出心脏并称重，计算心脏系数。
④心脏用4℃冷生理盐水清洗后，切取左心室部分肌组织约100mg，制备10％心肌组织匀浆，离心取上清液，-20℃保存备用，采用ELISA法检测大鼠心肌组织中的NF-κB、TNF-α、ICAM-1含量。
⑤安静对照组和模型组每组各取2只大鼠心肌组织做电镜，观察心肌组织超微结构改变。
⑥每组各取5只大鼠剩余心肌放入福尔马林中固定三天后，取左心室心肌组织，常规脱水、石蜡包埋、切片，备用，经木精-伊红染色(Hematoxylin-eosinstaining，HE stain)观察心肌组织病理学改变;免疫组织化学方法检测心肌组织中NF-κB、TNF-α、ICAM-1蛋白表达水平和细胞凋亡。
⑦各组另取5只大鼠心肌组织两块各约100mg，用液氮迅速制备心肌冰冻标本，-70℃保存备用，采用免疫印迹(Western blotting)检测心肌组织中NF-κB、TNF-α、ICAM-1蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-timefluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)检测心肌组织中TNF-αmRNA、NF-κ BmRNA和ICAM-1mRNA基因表达水平。
⑧采用心脏灌流酶消化法制备分离心肌细胞，经Hoechst33325染色观察苦苣提取物对大鼠心肌细胞凋亡的影响。
结果：
1.大鼠一般状况、体重及心脏系数
(1)与安静对照组比较，力竭性运动模型组大鼠游泳结束后普遍会出现呼吸急促、嗜睡，部分大鼠出现腹泻症状，游泳到第5～7天，状态明显下降，游泳时间缩短，皮毛光洁度差，对外界的反应迟缓，竖毛、皮毛脱落等。苦苣提取物3.2g/kg可以明显改善上述状况。
(2)与安静对照组比较，反复力竭性运动模型组各组大鼠体重均具有不同程度的明显减轻(P＜0.05和P＜0.01)，其中以运动后24h和96h组体重减轻最大(P＜0.01);苦苣提取物3.2g/kg、1.6g/kg给药24h组和48h组大鼠体重均有明显增加。
(3)与安静对照组比较，反复力竭性运动后即刻、6h、48h组大鼠的心脏系数均有显著增加(P＜0.05和P＜0.01);苦苣提取物3.2g/kg、1.6g/kg给药后48h组与运动后48h组比较心脏系数均明显降低，具有显著性差异(P＜0.05)。
2.苦苣提取物对大鼠血清中心肌酶谱CK和CK-MB的影响与安静对照组比较，反复力竭性运动后24 h和48h组大鼠血清CK和CK-MB活性皆有明显增加(P＜0.05和P＜0.01)，苦苣提取物小剂量给药24h组大鼠血清CK和CK-MB活性均有所降低，但无明显统计学差异(P＞0.05);苦苣提取物3.2g/kg给药24h组和48h组以及1.6g/kg给药48h组大鼠血清CK和CK-MB活性均明显降低(P＜0.05和P＜0.01)。
3.力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织超微结构和形态学改变及苦苣提取物的干预作用
(1)电镜下观察到安静对照组大鼠心肌组织超微结构正常。反复力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织超微结构均有不同程度的损伤;其中以运动后48h为最严重。
(2)光学显微镜下观察到安静对照组大鼠心肌组织结构正常。力竭性运动后24h组和48h组大鼠心肌组织均出现局部肌细胞排列不规则，横纹不清晰，核增大，散在点灶状炎症坏死等病理改变外，48h多数肌细胞发生溶解性坏死。苦苣提取物3.2g/kg给药24h组以及苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg给药48h组大鼠心肌组织均有所改善。
4.力竭性运动后不同时相大鼠血清中TNF-α、 NF-κB和ICAM-1含量的动态变化及苦苣提取物的干预作用——ELISA法
(1)与安静对照组比较，反复力竭性运动后24h和48h组血清中TNF-α浓度显著升高(P＜0.05)，其余各组均有升高趋势，TNF-α浓度高峰出现在运动后24h;运动后即刻、3h和6h组大鼠血清中NF-κB浓度均明显降低(P＜0.01和P＜0.05)，而运动后12h、24h、48h和96h组NF-κB浓度均显著升高(P＜0.01)，24h达高峰，呈现先低后高走势;运动后12h、24h、48h和96h组大鼠血清中ICAM-1浓度均明显增加(P＜0.01和P＜0.05)，运动后即刻～6h血清中ICAM-1无明显变化(P＞0.05)，峰值出现在运动后96h。
(2)与力竭性运动后24h组比较，苦苣提取物3.2g/kg给药24h组大鼠血清中TNF-α、NF-κB和ICAM-1浓度均显著降低(P＜0.05)，苦苣提取物1.6g/kg使大鼠血清NF-κB浓度显著降低(P＜0.05);与运动后48h组比较，苦苣提取物3.2g/kg给药48h组均使大鼠血清中TNF-α、NF-κB和ICAM-1浓度显著降低(P＜0.05和P＜0.01)，苦苣提取物1.6g/kg均使血清TNF-α、NF-κB浓度显著降低(P＜0.05)。
5.力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织中TNF-α、 NF-κB和ICAM-1含量的动态变化及苦苣提取物的干预作用——ELISA法
(1)与安静对照组比较，反复力竭性运动后3h、24h和48h组大鼠心肌组织中TNF-α含量均显著升高(P＜0.05)，运动后即刻、6h、12h和96h有升高趋势，3h和48h分别达高峰，呈双峰变化;力竭性运动后3h、6h、12h、24h、48h和96h组大鼠心肌组织中NF-κκB含量均明显升高（P＜0.05和P＜0.01），3h和48h分别达高峰，呈双峰变化;运动后即刻、3h、6h、12h和24h组大鼠心肌组织中ICAM-1含量均显著升高(P＜0.05)，3h达高峰，随后逐渐降低。
(2)与力竭性运动后24h组比较，苦苣提取物3.2g/kg给药24h组大鼠心肌组织中TNF-α、NF-κB和ICAM-1浓度均显著降低(P＜0.05)，苦苣提取物1.6g/kg使大鼠心肌组织NF-κB浓度显著降低(P＜0.05);与运动后48h组比较，苦苣提取物3.2g/kg给药48h组均使大鼠心肌组织中TNF-α和NF-κB显著降低(P＜0.05)，苦苣提取物1.6g/kg均使心肌组织中TNF-α、NF-κB浓度显著降低(P＜0.05)。
6.力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织中TNF-α、 NF-κB和ICAM-1蛋白的表达及苦苣提取物的干预作用——免疫组织化学法
(1)与安静对照组比较，力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织中TNF-α、NF-κ B和ICAM-1蛋白表达均有增多，其中运动后48h TNF-α蛋白表达最多，运动后3h NF-κ B蛋白表达最多，运动后即刻ICAM-1蛋白表达最多。
(2)与力竭性运动后24h组比较，苦苣提取物3.2g/kg给药24h组大鼠心肌组织中TNF-α蛋白表达有所减少，NF-κB和ICAM-1蛋白表达显著减少;与运动后48h组比较，苦苣提取物3.2g/kg给药48h组大鼠心肌组织中TNF-α、NF-κB和ICAM-1蛋白表达均明显减轻，苦苣提取物1.6g/kg使NF-κB和ICAM-1蛋白表达均明显减轻。
7.力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α和ICAM-1蛋白表达及苦苣提取物的干预作用—Western-blotting法
(1)Western-blotting实验结果显示，与安静对照组比较，力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织中TNF-α、NF-κB和ICAM-1蛋白表达均显著升高，其中TNF-α蛋白表达以运动后48h组为最高，NF-κB表达以运动后即刻、12h和48h分别达高峰，ICAM-1蛋白表达以运动后24h达高峰。
(2)与力竭性运动后24h组比较，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg给药24h组均使大鼠心肌组织中TNF-α、NF-κκB和ICAM-1蛋白表达有所减少;与力竭性运动后48h组比较，苦苣提取物3.2g/kg给药48h组大鼠心肌组织中TNF-α和NF-κB蛋白表达降低更为明显。
8.力竭性运动后不同时相心肌组织中TNF-αmRNA、NF-κBmRNA和ICAM-1mRNA的表达及苦苣提取物的干预作用——qRT-PCR法
(1)qRT-PCR实验结果显示，与安静对照组比较，反复力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织中TNF-α mRNA、NF-κB mRNA和ICAM-1mRNA水平均显著升高(P＜0.05和P＜0.01)，其中运动后48h达高峰。
(2)与力竭性运动后24h组比较，苦苣提取物3.2g/kg给药24h组使大鼠心肌组织中TNF-α mRNA、NF-κB mRNA和ICAM-1 mRNA表达水平均显著降低，苦苣提取物1.6g/kg使TNF-α mRNA明显降低，NF-κB mRNA和ICAM-1mRNA表达水平有所下降。与力竭性运动后48h组比较，苦苣提取物3.2g/kg给药48h组大鼠心肌组织中TNF-α mRNA、NF-κB mRNA和ICAM-1 mRNA表达水平明显下降(P＜0.05和P＜0.01)。
9.力竭性运动后不同时相大鼠心肌细胞凋亡的动态变化及苦苣提取物的干预作用——TUNEL法和Hoechst33325染色法
(1)TUNEL法结果显示，安静对照组大鼠心肌组织存在少数散在的细胞凋亡;反复力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织均出现大量细胞凋亡，心肌细胞凋亡指数均明显增加(P＜0.01)，48h达高峰，且具有一定的时间依赖性特点。
(2)Hoechst33325染色实验结果显示，安静对照组大鼠灌流后的悬浮心肌细胞核多较完整，反复力竭性运动后24h和48h组均观察到大量的核断裂、浓染、固缩、核质不均匀等细胞凋亡的形态;与运动后24h和48h组相比，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg均明显改善细胞凋亡状态，凋亡细胞数目均有减少，3.2g/kg作用更为明显。
结论
1.1周反复力竭性运动可以成功地建立延迟性心肌损伤模型。
2.大鼠心肌酶谱和心肌组织结构改变均证实，反复力竭性运动可以引起运动后恢复期不同时间点大鼠心肌组织不同程度的损伤。苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg可以改善力竭性运动诱发的心肌超微结构损伤和形态学改变。
3.ELISA法、免疫组化法以及Western-blotting法均证实，反复力竭性运动可以引起运动后恢复期不同时间点大鼠血清和心肌组织中TNF-α、NF-κ B和ICAM-1蛋白表达不同程度的升高，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg可以降低TNF-α、NF-κ B和ICAM-1蛋白表达水平。
4.qRT-PCR法证实，反复力竭性运动后不同时相心肌组织中TNF-α mRNA、NF-κ BmRNA和ICAM-1mRNA表达均有不同程度的升高，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg可以明显降低TNF-α mRNA、NF-κ BmRNA和ICAM-1mRNA表达水平。
5.TUNEL法和Hoechst33325染色法均证实，反复力竭性运动后不同时相大鼠心肌组织均出现大量细胞凋亡，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg均明显减少心肌细胞凋亡。
6.不同方法进一步证实了炎症介质NF-κB、TNF-α、ICAM-1和心肌细胞凋亡在力竭性运动诱发延迟性心肌损伤的发生发展中起着重要作用。
7.苦苣提取物对力竭性运动所致的延迟性心肌损伤具有保护作用，其机制可能与降低心肌组织中NF-κB、TNF-α、ICAM-1的表达和细胞凋亡有关。
力竭性运动;心肌损伤;运动性猝死;苦苣提取物干预;炎性因子
济南大学
硕士
药理学
王福文
2013
中文
R873.05;R542.2
110
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）