辣椒细胞质雄性不育相关基因的克隆及表达研究
辣椒（Capsicum annuum L.）原产中南美洲，是一种世界性的蔬菜和加工调味品，据农业部统计，从2000年起全国每年栽培面积在140万公顷左右，是我国第二大蔬菜作物。作为常异花授粉植物，辣椒的杂种优势极为显著，F1代杂交品种在生产上已得到广泛应用。辣椒细胞质雄性不育系是杂种优势利用的基础和重要途径，是当今世界辣椒育种的主攻方向。为了更好地利用辣椒细胞质雄性不育系进行杂种优势育种，进一步阐述和丰富辣椒细胞质雄性不育的相关机理，本文以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为材料，采用CTAB法提取基因组DNA，采用蔗糖沉淀与差速离心相结合的方法提取线粒体DNA，运用SRAP分子标记技术研究和分析辣椒细胞质雄性不育系争保持系DNA差异，寻找与辣椒细胞质雄性不育相关的分子标记，利用实时荧光定量PCR技术对找到的不育相关特异片段的表达情况进行了研究，主要研究结果如下:
1.辣椒细胞质雄性不育系及其保持系基因组DNA-SRAP分子标记研究
利用SRAP分子标记技术对辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应保持系21B的基因组DNA进行比较分析，64对SRAP引物组合共扩增获得了1792条从100bp-1000bp大小不同的条带，平均每对引物组合扩增出28条清晰的条带，共检测到4个多态性位点，其中不育系材料中2个，将差异片段进行回收、克隆测序，特异片段Me7Em4-280和Me2Em7-230序列全长分别为283bp和236bp，经NCBI数据库比对分析表明，Me7Em4-280核苷酸序列与多种植物的NADH dehydrogenase subunit D(ndhD) gene具有较高的同源性，片段Me2Em7-230与Oryza sativa Indica Group strain WA-CMSmitochondrion基因同源性为74％。根据差异片段序列特点设计特异SCAR引物，在不育系和保持系单株DNA中进行扩增验证，都仅在不育系中扩增出目的条带，从而推测本研究获得的两个SCAR标记很可能与细胞质雄性不育基因紧密连锁。
2.辣椒细胞质雄性不育系及其保持系线粒体DNA-SRAP分子标记研究
以辣椒细胞质雄性不育系21A及其保持系21B为材料，采用差速离心与蔗糖沉淀相结合的方法提取辣椒黄化苗线粒体DNA，进行SRAP分子标记，结果表明:(1)128对引物组合共扩增获得了3072条100～1000bp的条带，多态性位点仅有9个，占0.29％,其中7条多态性条带位于21A中。(2)对多态性条带回收、克隆和测序，分析比对后发现，9个克隆在Genbank中找到了相似的功能，绝大部分与能量代谢有关。(3)根据21A中的多态性序列特点设计特异SCAR引物，在21A和21B的单株基因组DNA中进行扩增验证，4对引物在21A中扩增出目的条带，表明已成功地将SRAP标记转化为SCAR标记，是新发现的与辣椒细胞质雄性不育基因相关的片段。
3.辣椒细胞质雄性不育相关基因的表达分析
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术作为一种精确的基因表达分析技术而广泛应用于多种植物的表达研究中。本文利用荧光定量PCR技术对从辣椒细胞质雄性不育系21A线粒体DNA分离出的与不育性状相关的基因CMS721在不同组织中的表达情况进行了分析。结果表明:该基因只在不育系中表达，并且在所检测的组织中均有表达，但表达量差异很大，基因表达量在中花蕾时期迅速下降，推测该基因控制辣椒花药中与能量代谢相关的蛋白的表达，中花蕾时期表达量减少，能量代谢异常，引起小孢子发育障碍，最终导致雄性不育。
这些研究结果为进一步深入探讨辣椒细胞质雄性不育的分子机理奠定了基础。
辣椒;细胞质雄性不育;线粒体;实时荧光定量;基因表达
南京农业大学
硕士
蔬菜学
王述彬
2012
中文
S641.3
89
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）