耐盐基因StP5CS转化结球甘蓝的研究
结球甘蓝是十字花科（Cruciferase）芸薹属（Brassica）植物，是我国重要的叶菜类蔬菜之一。土壤盐渍化严重影响着我国的农业生产和生态环境，我国还有大面积的盐碱地，培育耐盐结球甘蓝品种成为一个日益紧迫而意义重大的研究课题。本研究以几个结球甘蓝高代纯合系为试验材料，建立并优化结球甘蓝再生及遗传转化体系，通过农杆菌介导法和floral-dip转化法两种方法，将耐盐基因StP5CS导入结球甘蓝中，获得转基因植株。采用PCR、Southern blot和RT-PCR等技术对转基因植株进行鉴定，并对其进行了盐胁迫处理。主要研究结果如下:
1.以结球甘蓝G1、G2和G3的具柄子叶和下胚轴为外植体，研究了苗龄、不同激素浓度配比、添加不同浓度AgNO3对外植体不定芽诱导率的影响，建立并优化了结球甘蓝再生体系:5d苗龄的外植体再生频率最高;G1是较好的基因型，其下胚轴接种于MS+1.0 mg/L6-BA+0.05mg/L NAA时不定芽的再生频率最高，为76.51％，具柄子叶接种于MS+4.0 mg/L6-BA+0.05mg/L NAA时不定芽的再生频率较高，为73.63％;在培养基中添加银离子可以减轻结球甘蓝外植体的褐化，促进不定芽的再生，AgNO3的浓度为7.5 mg/L时再生频率最高，为80.86％。
2.以G1的具柄子叶和下胚轴为受体，采用农杆菌介导法进行耐盐基因StP5CS的遗传转化，对双丙氨膦选择压、侵染时间、预培养时间、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)浓度等因素进行研究，建立并优化了遗传转化体系:4mg/L、8mg/L的双丙氨膦浓度分别可以有效的筛选出下胚轴及具柄子叶的转基因植株;G1下胚轴预培养2d，经OD600≈0.5农杆菌侵染5 min后，接种于添加0.1 mmol/L AS的PM1培养基上共培养2d，转入SM2培养基中筛选，转化率最高达24.47％。
3.采用优化的农杆菌介导转化体系，对G1进行转化，共获得了86株抗性苗。利用PCR扩增、southern blot及RT-PCR检测外源基因StP5CS的整合与表达，结果表明，有23株抗性苗PCR、 southern blot及RT-PCR检测均呈阳性，扩增到639bp的条带，与StP5CS基因完全一致，证实StP5CS基因已经整合进入G1基因组中，并得到了表达。用未转化的结球甘蓝植株及转基因植株进行梯度盐胁迫试验，通过测定SOD、脯氨酸的含量及相对膜透性表明转基因植株耐盐性明显提高。
4.采用floral-dip法转化结球甘蓝G1、G2和G4，通过对影响该转化法的几个关键因素（表面活性剂silwet L-77的浓度、转化液中蔗糖的浓度、植物生长状态）的研究，建立了较优的floral-dip转化法体系，结果表明:silwet L-77的浓度为0.05％、蔗糖的浓度为10％，花序上花蕾的长度＜8 mm的条件下，喷施除草剂Basta后成活率最高，为6.87％。通过对抗性植株进行PCR、Southern blot和RT-PCR检测，确定目的基因已经整合到结球甘蓝的基因组中并得到有效的表达。
结球甘蓝;再生体系;耐盐性;StP5CS基因;遗传转化;转基因植株
南京农业大学
硕士
蔬菜学
严继勇
2012
中文
S635.1;S603
81
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）