水稻高亲和硝酸盐转运蛋白基因OsNRT2.3a/B生物学功能分析
水稻是全世界最重要的粮食作物之一，占全球谷类作物种植面积的1/3，世界上约有50％的人口以稻米为主食。在作物所有必需营养元素中，氮是限制植物生长和形成产量的首要因素。氮(N)素是作物从土壤中吸收量最多的元素，其对作物的生命活动和产量形成具有重要意义。土壤中植物所利用的主要氮素形式是铵态氮(NH4+)和硝态氮(NO3-)。尽管在淹水条件下土壤中氮素主要以铵态氮形式存在，但是有研究表明水稻根系能够泌氧，从而在硝化细菌作用下将根际土壤中铵态氮转化为硝态氮，在潮湿土壤状况下水稻根系吸收硝态氮占总氮量的25％～40％。植物为了能够适应土壤中NO3-浓度梯度差异环境，进化出NO3-高、低亲和吸收转运系统。近年来人们从分子水平上对硝态氮的吸收系统进行了大量研究。已发现两类基因NRT1和NRT2分别于与低亲和硝态氮转运系统(LATS)和高亲和硝态氮转运系统(HATS)有关。目前已从多种植物中克隆了高、低亲和硝态氮运输系统的基因，特别是对模式植物拟南芥的研究较为深入。
尽管在水稻中已经克隆到了五个NRT2家族的硝酸盐转运蛋白基因，但是对它们功能特性的研究还十分有限。本试验以水稻高亲和硝酸盐转运蛋白基因OsNRT2.3a和OsNRT2.3b为研究对象，利用超表达及RNAi技术获得OsNRT2.3a/b超表达和OsNRT2.3a RNAi转基因材料;通过RT-PCR、qRT-PCR、TAIL-PCR、Southern blot、Western blot等方法分析转基因材料超表达及沉默效果;15N同位素示踪分析转基因材料对硝酸盐的吸收及转运;田间试验分析转基因材料的产量性状以及利用基因芯片对转基因材料全基因组表达进行分析，研究了水稻OsNRT2.3a/b基因的生物学功能，所获得的主要研究结果如下:
1.通过生物信息学分析表明水稻高亲和硝酸盐转运蛋白基因OsNRT2.3在转录过程中通过选择性剪切产生OsNRT2.3a和OsNRT2.3b两个转录本，OsNRT2.3a和OsNRT2.3b在cDNA序列上差异非常小，OsNRT2.3b相对OsNRT2.3a有一个90bp长的内含子，且5'端和3'端非编码区都长于OsNRT2.3a;芯片结果表明田间生长条件下OsNRT2.3a/b在根部表达量最高，地上部叶片也有表达，其他部位表达量较低;从完整生育期来看，OsNRT2.3a/b在叶片中的表达量随着植株的生长而增高，在植株营养生长向生殖生长过渡的阶段达到最大值，之后表达量降低到一个相对稳定的范围;水稻原生质体亚细胞定位实验表明OsNRT2.3a和OsNRT2.3b都是细胞质膜定位的跨膜蛋白，与生物信息学预测结果一致。
2.通过水稻转基因分别得到了OsNRT2.3a、OsNRT2.3b的超表达转基因水稻材料和OsNRT2.3a RNAi沉默转基因水稻材料，通过RT-PCR鉴定了目的基因超表达及RNAi的阳性株系，并且通过southern blot和TAIL-PCR筛选到了独立的单拷贝插入在基因组非编码区的转基因株系，进一步通过Western blot验证了蛋白水平上的超表达及沉默效果，通过繁种获得了遗传性状稳定的超表达及沉默转基因株系。
3.通过OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的超表达转基因水稻植株的表型发现单独超表达OsNRT2.3a基因的转基因植株与野生型水稻相比没有明显的表型差异，而单独超表达OsNRT2.3b基因的转基因植株与野生型水稻相比株型显著增大。对超表达植株中OsNRT2s和OsNAR2.1的表达分析表明，OsNRT2.3a超表达并没有影响OsNR T2.1、OsNRT2.2和OsNAR2.1的表达;OsNRT2.3b超表达植株中OsNRT2.1、OsNRT2.3a和OsNAR2.1的表达都显著上调，而OsNRT2.4的表达量基本不受影响。在水稻中单独超表达OsNRT2.3a基因并不能明显影响水稻的生长，也没有提高水稻对氮素的吸收;在不同浓度及形态的氮素处理条件下，OsNRT2.3b超表达植株生物量都显著大于野生型植株，而总氮浓度除了在高浓度铵态氮处理下与野生型无显著差异外，其他条件下均较野生型低，但整个植株的总氮含量在OsNRT2.3b超表达植株中都要显著高于野生型。
4.对OsNRT2.3b超表达植株与野生型在不同施氮水平下的田间试验表明，OsNRT2.3b超表达水稻长势在各个施氮水平下均要好于野生型，且平均单株产量和氮素利用效率都显著高于野生型。同时我们也发现，OsNRT2.3b超表达水稻的生育期相比野生型有所推迟，其差异主要体现在抽穗期比野生型推迟，且随着施氮量的增加，OsNRT2.3b超表达水稻生育期推迟的天数也随着增加。进一步对OsNRT2.3b超表达植株生育期差异的研究表明，OsNRT2.3b超表达不仅能提高水稻干物质积累总量和后期干物质转运量，而且能显著提高水稻后期干物质转运率和转运干物质贡献率;OsNRT2.3b超表达不仅能提高水稻氮素积累总量和后期氮素转运量，而且能显著提高水稻后期氮素转运率和转运氮贡献率。
5.通过对OsNRT2.3a RNAi沉默突变体的分析表明，OsNRT2.3a基因沉默不会显著影响外界低NO3-条件下水稻根系对NO3-的吸收，同时OsNRT2.3a也没有参与硝酸盐从老叶（氮源）到新叶（氮库）的再移动，但OsNRT2.3a基因的沉默会抑制NO3-从地下部往地上部的转运，从而导致水稻根系NO3-的积累，进而间接下调OsNRT2.1/2.2的表达量，最终导致水稻根系减少从外界环境中吸收硝酸盐。
6.对OsNRT2.3a超表达及沉默突变体的全基因组表达谱芯片分析表明OsNRT2.3a沉默突变体由于地上部氮素含量不足影响植株碳氮循环，进而影响到植株的光合作用，导致干物质积累减少、植株生长矮小;OsNRT2.3b超表达植株全基因组表达谱芯片分析表明OsNRT2.3b基因超表达可能适当抑制了光呼吸的同时提高了植株体内抗氧化活性，从而延缓植株的衰老，提高植株干物质的积累及产量。
综上所述，水稻高亲和硝酸盐转运蛋白基因OsNRT2.3a主要在硝酸盐从地下往地上部的运输过程中起关键作用;OsNRT2.3b超表达能够显著提高水稻前期对氮素的积累和后期对氮素的转运，进而提高水稻氮素利用效率和增加产量。
水稻;氮素营养转运;硝酸盐转运蛋白;OsNRT2.3a基因;OsNRT2.3b基因;生物学功能
南京农业大学
博士
植物营养学
徐国华
2012
中文
S511.01
165
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）