拟南芥FRIGIDA-LIKE蛋白家族居员AtFRL4基因及其上游调控序列的克隆与转化研究
开花是植物由营养生长向生殖生长过渡的重要标志，是植物完成生活周期的重要阶段。对植物开花机制的研究可为牧草及种子生产提供依据，有利于人们根据生产生活需要进行合理的利用。本研究针对一个FRIGIDA-LIKE蛋白家族成员AtFRL4基因（座位号:At4g14900）及其上游启动子AtFLP进行研究，以期确定该基因的功能，探明其基因表达调控机制。
从NCBI中检索得到AtFRL4基因的编码区序列，并利用PCR法分离得到其全长。AtFRL4基因cDNA全长1934bp，与FRI(At4g00650)存在38.9％的同源性。其编码的蛋白包含532个氨基酸，与FRI具有24％的同源性，具有FRIGIDA多结构域和WWbp结构域，为富含羟脯氨酸糖蛋白，属于FRIGIDA-LIKE蛋白家族。
同时，为了解AtFRL4蛋白在植物细胞中的定位情况，构建AtFRL4与GFP基因融合的表达载体pA7-GFP-AtFRL4。通过基因枪转化洋葱表皮细胞，利用CaMV35S启动子调控融合蛋白在细胞中瞬时表达。GFP荧光检测结果表明:融合蛋白在细胞核集中表达，在细胞膜表达量较少。
为确定AtFRL4基因的功能，本研究构建AtFRL4与报告基因GUS融合的超表达载体pBI-AtFRL4，使用农杆菌介导法转化烟草，使其在烟草中过量表达来探索其功能，验证其对开花的影响。通过对具有卡那霉素抗性的幼苗进行DNA与RNA水平的PCR检测，最终获得了9株含有AtFRL4目的基因的转基因烟草植株。通过对该9株AtFRL4转基因T0代再生植株进行开花统计分析，结果发现该基因可能参与植物开花调控，具有推迟开花的作用。
为研究内外环境对AtFRL4基因表达的调控机制，利用PCR法分离得到AtFRL4基因上游1690bp的启动子序列AtFLP。经预测该段序列包含光照，温度，激素等多种顺式作用元件，且可能与开花调控相关。本研究以基因自身启动子AtFLP片段代替异源CaMV35S强启动子，构建AtFLP启动子与GUS融合的表达载体pBI-AtFLP，并以农杆菌侵染烟草叶盘的方法进行转化。经PCR检测，证明6株有卡那霉素抗性的再生苗均为AtFLP转基因烟草。对其根、叶、花进行GUS染色发现，GUS蛋白主要在花柱，花药和花丝等组织表达，而在叶，花萼，花瓣等部位较少。同时，通过ABA、IAA、 GA3、 MeJA、低温胁迫和黑暗处理对AtFLP转基因T0代烟草进行诱导，GUS组织化学染色结果发现:黑暗处理可促进GUS基因的表达，而4℃低温胁迫则抑制GUS基因的表达。
拟南芥;AtFRL4基因;AtFLP启动子;超表达;调控机制;转基因烟草
南京农业大学
硕士
草业科学
杨青川;沈益新
2012
中文
S572.035.1
73
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）