紫花苜蓿MsRBP基因的克隆及其功能鉴定
转录后调控是基因表达过程中重要的调节机制之一，影响着植物正常的生长发育和抗逆等生命过程。RNA结合蛋白(RBPs)是转录后水平调控基因表达的主要承担者，普遍存在于各种生物体中。它通过直接结合或间接调控而广泛的参与到转录后调节的多个环节，在RNA加工过程中发挥着极其重要的作用。迄今，已从许多植物中克隆得到了大量不同种类的RNA结合蛋白，有研究表明，RNA结合蛋白参与植物的多种胁迫应答过程。但至今未见有关紫花苜蓿RNA结合蛋白研究的相关报道。
本研究以紫花苜蓿耐盐品种“中苜一号”为材料，根据表达序列标签(EST)(GenBank accession No.FE896907.1)序列，采用RACE技术克隆得到了紫花苜蓿RNA结合蛋白基因的全长序列，并通过生物信息学和分子生物学等分析方法和技术进一步对该基因的结构、功能进行了初步鉴定。主要结果如下:
1)利用RACE技术，克隆得到了一个编码紫花苜蓿RNA结合蛋白基因的全长cDNA序列，命名为MsRBP(GenBank accession No.JN986878.1)。生物信息学分析表明，该基因全长1551 bp，包含一个1230 bp的完整开放阅读框，5'端非编码区(UTR)长69 bp，3'端UTR长252 bp。该基因编码长度为409个氨基酸的蛋白，其理论分子量为45.6 kDa，等电点为6.31。表达的蛋白质N端含有3个RRM型RNA结合结构域，C端为一个谷氨酰胺和脯氨酸富含结构域。
2)成功构建了瞬时融合表达载体pA7-GFP-MsRBP，亚细胞定位分析结果显示MsRBP编码蛋白定位于细胞核。
3)对MsRBP基因在不同胁迫条件下的表达特性进行了分析。实时荧光定量PCR结果表明:300mMNaCl、20％ PEG6000和100μM ABA均能诱导MsRBP基因表达量上调;300mMNaCl处理初期（4h前），MsRBP表达量上升并不明显，10h时达到最大值，这一变化在根中表现的尤为突出;ABA和PEG处理时，MsRBP表达量在短时间内(2h-4h)急剧上升，处理24h时其表达仍高于对照，表明该基因对ABA和PEG非常敏感且持续时间较长。
4)成功构建了植物超表达载体pBI121-MsRBP，并利用农杆菌介导的方法在烟草NC89和紫花苜蓿“中苜一号”中进行了过量表达。经抗性筛选和分子检测分析，分别得到了3株阳性再生转基因烟草和2株阳性再生转基因苜蓿。
5)利用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，并经过三次抗性筛选和分子检测分析，得到了6株T2代转基因拟南芥植株。对转基因株系进行耐盐性分析，结果表明:过表达MsRBP基因增加了转基因拟南芥对NaCl的敏感性;盐胁迫下，与野生型对照相比，转基因拟南芥的种子萌发率降低、苗期主根生长受到抑制。即过表达Ms RB基因后拟南芥的耐盐性降低。
紫花苜蓿;RNA结合蛋白;表达分析;遗传转化;MsRBP基因;功能鉴定
南京农业大学
硕士
草业科学
杨青川;沈益新
2012
中文
Q78;S541.9
84
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）