清热化瘀颗粒对大鼠脑缺血预处理后内质网应激ATF6、GADD153表达的影响
目的:观察清热化瘀颗粒对大鼠脑缺血预处理后内质网应激ATF6、GADD153表达的影响，探讨清热化瘀颗粒预处理对局灶性脑缺血大鼠的神经元保护作用。
方法:将200只大鼠随机分为五组，即假手术组(sham-operation，SO);MCAO组:假手术+脑缺血组（SO+MCAO）;BIP组:预缺血+脑缺血组（BIP+MCAO）;QRHY组:预缺血+清热化瘀颗粒+脑缺血组(BIP+QRHY+MCAO);QKL对照组:预缺血+清开灵颗粒+脑缺血组(BIP+QKL+MCAO)，每组40只。每组按照再缺血后12h、1d、2d、3d四个时间点平均分为4个亚组(n=10)。采用大鼠大脑中动脉二次线栓法制备大鼠脑缺血预处理模型，分别作如下处理:假手术组（SO组）:以假手术代替预缺血及缺血再灌注，线栓只插入颈内动脉9mm，然后正常饲养，自由饮水;MCAO组:以假手术代替预缺血，其余步骤同脑缺血预处理组，动物造模后正常饲养，自由饮水，灌胃等体积的生理盐水;BIP组:MCAO10min后抽出栓线，完成预缺血;3d后再次行MCAO2h，灌胃等量生理盐水，再灌注后12h、1d、2d、3d处死;QRHY组:缺血预处理10min后，在大鼠麻醉清醒后1h灌胃清热化瘀颗粒溶液，连续3d，每天上、下午各一次。3d后给予2hMCAO，再灌注后12h、1d、2d、3d处死;QKL对照组:以灌胃清开灵汤颗粒溶液代替清热化瘀颗粒溶液，余操作步骤同QRHY组。造模后取材，常规HE染色并在光学显微镜下观察各组脑组织病理形态学改变，采用免疫组化检测ATF6、GADD153蛋白在大鼠缺血半暗带表达的变化。采用实时荧光定量PCR检测ATF6的mRNA水平在大鼠缺血半暗带表达的变化。
结果:(1)对ATF6蛋白，再灌注后ATF6蛋白表达平均灰度值明显下降，表明其蛋白阳性数明显增多（P＜0.01），MCAO组大鼠脑缺血再灌注24h缺血半暗带ATF6表达达小低峰（P＜0.01），随再灌注时间延长其表达逐渐升高，但仍保持较低表达水平(P＜0.01)。BIP组能明显降低大鼠缺血再灌注损伤后ATF6蛋白表达平均灰度值水平，即能升高阳性细胞表达数，与MCAO组比较，BIP组大鼠12h至1dATF6蛋白表达平均灰度值明显下降(P＜0.05)，清热化瘀颗粒预处理组表达较单纯缺血再灌注组低(P＜0.01)，与BIP组比较，大鼠1dATF6蛋白表达平均灰度值明显降低（P＜0.05），且与脑组织病理形态学改变相一致。说明清热化瘀颗粒预处理能够促进梗死后ATF6表达。QRHY组与QKL对照组比较，1d至2dATF6蛋白表达平均灰度值明显下降，说明相比清开灵颗粒，清热化瘀颗粒能够更好的促进梗死后ATF6表达。
(2)对GADD153蛋白，再灌注1d其平均灰度值降至最低，表明其阳性细胞表达达高峰(P＜0.01)，至再灌注2d其蛋白表达平均灰度值仍高。BIP组能明显升高大鼠缺血再灌注损伤后GADD153蛋白表达平均灰度值水平，即能降低阳性细胞表达数，与MCAO组比较，BIP组大鼠12h至1dGADD153蛋白表达平均灰度值明显上升（P＜0.01）。清热化瘀颗粒预处理组表达较单纯缺血再灌注组低（P＜0.01），与BIP组比较，大鼠1dGADD153蛋白表达平均灰度值明显上升（P＜0.05），且与脑组织病理形态学改变相一致。说明清热化瘀颗粒预处理能够抑制梗死后GADD153表达。QRHY组与QKL对照组比较，1d至2dGADD153蛋白表达平均灰度值明显上升，说明相比清开灵颗粒，清热化瘀颗粒能够更好的抑制梗死后GADD153表达。
(3)荧光定量PCR结果显示，SO组有少量表达;MCAO组大鼠脑缺血再灌注24h缺血半暗带ATF6mRNA表达达高峰(P＜0.01)，随再灌注时间延长其表达逐渐下降，但仍保持较高表达水平（P＜0.01）;BIP组缺血各时间点其表达水平较MCAO组均明显升高（P＜0.05，P＜0.01）;QRHY组和QKL对照组较BIP组各时间点其表达水平进一步升高(P＜0.05)。QRHY组较QKL对照组各时间点其表达水平进一步升高（P＜0.05）。
结论:(1)脑缺血再灌注诱发了内质网应激，启动了ATF6介导的UPR信号通路。(2)清热化瘀颗粒预处理通过上调大鼠脑缺血再灌注后ATF6的表达，抑制内质网应激反应及随后的凋亡信号通路，抑制前凋亡因子GADD153蛋白的合成，从而发挥其神经保护作用，减轻脑缺血再灌注损伤，可以改善脑缺血再灌注后大鼠神经功能缺损并减少梗死体积。而在通过影响ERS后ATF6信号转导通路相关基因的表达，抑制前凋亡因子GADD153蛋白的合成，进而抑制细胞凋亡，保护神经细胞方面。清热化瘀颗粒比清开灵颗粒有更好的作用。
清热化瘀颗粒;内质网应激;局灶性脑缺血;神经元保护
广西中医药大学
硕士
中医内科
胡跃强
2013
中文
R743.3;R285.5
70
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）