农杆菌介导小反刍兽疫病毒H、F基因转化苜蓿的初步研究
本文利用农杆菌介导法，将小反刍兽疫病毒H基因转入苜蓿中，为制备防治小反刍兽疫的转基因牧草疫苗奠定基础。
小反刍兽疫病毒(PPRV)植物表达载体的构建是采用TA克隆的方法，从PPRV质粒中分别扩增出H，F基因，在H基因终止密码子前加入KDEL序列，形成H-KDEL，烟草SRI中扩增出促进外源基因表达的MAR12序列和MAR34序列，pHL005质粒中扩增出报告基因-绿色荧光蛋白GFP基因，以上克隆均带有相应酶切位点，结果显示所克隆的基因和序列均与理论大小相符，说明各种克隆载体构建成功。将GFP基因插入到表达载体pBI121替代GUS基因，便于植物活体组织检测;将PPRV-H、PPRV-H-KDEL基因插入到pBI121-GFP，构建植物表达栽体pBI121-GFP-H和pBI121-GFP-H-KDEL;将MAR序列插入到pBI121-GFP基因的一侧，构成中间载体MAR-pBI121-GFP，再将PPRV-H、PPRV-H-KDEL、PPRV-F插入MAR-pBI121-GFP，从而构成植物表达载体MAR-pBI121-GFP-H、MAR-pBI121-GFP-H-KDEL和MAR-pBI121-GFP-F。经酶切、PCR检测上述植物表达载体都构建正确。
成功构建表达载体后，用苜蓿品种甘农1号下胚轴为外植体，通过冻融法将植物表达载体pBI121-GFP-H转入农杆菌EHA105中。并且进一步采用叶片预培养3d，用农杆菌菌液侵染15min，在培养基上铺一层灭菌滤纸共培养3d后清洗，选择压为Km75mg/L，抑菌浓度为Cef300mg/L的措施优化了转化体系。在后续的筛选培养后获得具有卡那霉素抗性的愈伤组织，但没有得到抗性植株。经紫外灯照射，没有发现绿色荧光，提取苜蓿愈伤组织基因组的DNA，用PCR鉴定没有得到阳性愈伤组织，今后需要进一步研究。
小反刍兽疫病毒;苜蓿;表达载体构建;遗传转化;农杆菌介导法;H基因
青岛农业大学
硕士
草业科学
孙娟
2010
中文
S548
71
2013-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）