电离辐射对成骨细胞和破骨细胞中Notch信号通路的影响
目的:放射治疗广泛用于恶性肿瘤的治疗，同时也导致肿瘤周围正常组织受到辐射损伤。长期的放射治疗可以导致患者骨折、骨脱钙、骨变薄和骨硬化等骨损伤。在正常骨骼重建中，破骨细胞的骨吸收作用和成骨细胞的骨形成作用之间的动态平衡十分重要，而Notch信号通路对成骨细胞和破骨细胞的分化和成熟有着重要的影响。但是，辐射损伤的成骨细胞和破骨细胞中Notch通路成份变化及其对生长、功能变化的机制目前尚不清楚。本研究旨在研究成骨细胞和破骨细胞分化早期和分化晚期Notch信号通路中重要信号因子在电离辐射这一外源性刺激下所作出的适应性调节，并通过RNA干扰的方法降低Notch信号通路中关键因子NICD的表达水平，进而对放射治疗损伤机制进行研究。
方法:本研究采用了原代骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)和MC3T3-E1细胞通过诱导分化成为成骨细胞前体细胞（成骨细胞分化早期）和成骨细胞（成骨细胞分化晚期）;采用RAW264.7细胞通过诱导分化成为破骨细胞前体细胞（破骨细胞分化早期）和破骨细胞（破骨细胞分化晚期）。构建Notch胞内结构域(Notch intracellular domain，NICD)过表达的慢病毒载体，并通过RNA干扰的方法构建NICD稳定低表达的MC3T3-E1和RAW264.7细胞。经过0、2和4Gy137Csγ射线照射后，采用实时定量PCR以及Western Blot方法检测辐射对于Notch信号通路中关键信号因子以及成骨细胞和破骨细胞中标志性因子mRNA和蛋白水平表达的影响。并对电离辐射对成骨细胞前体细胞和成骨细胞增殖的影响进行了研究。
结果:本实验成功进行了NICD过表达慢病毒的包装工作，并且证实该慢病毒载体可以成功在HEK293T细胞中实现NICD的过表达。本实验研究发现NICD过表达可以导致MC3T3-E1细胞死亡，而RAW264.7细胞经NICD过表达慢病毒感染后，并不能稳定高表达NICD。通过RNA干扰的方法成功构建了NICD稳定低表达的MC3T3-E1和RAW264.7细胞。本研究成功将MC3 T3-E1和RNA干扰后的MC3T3-E1细胞诱导成为成骨细胞前体细胞和成骨细胞，将RAW264.7细胞和RNA干扰后的RAW264.7细胞诱导成为破骨细胞前体细胞和破骨细胞。经2或4Gy电离辐射后，成骨细胞和破骨细胞中Notch信号通路的受体(Notch1-4)、配体(Jagged1，Jagged2 and Delta1)、靶基因(Hes1)以及标志性因子(成骨细胞:ALP、M-CSF、RANKL和OPG;破骨细胞:TRAP、Intergrinβ3、RANK)发生了改变。而经RNA干扰则会导致电离辐射后基因变化趋势的改变。
结论:4Gy照射后源自BMSCs的成骨细胞Notch1表达水平上调，而对成骨细胞分化晚期产生抑制作用。2和4 Gy照射对源自BMSCs的成骨细胞前体细胞分化的抑制作用，可能是Notch1-4综合作用的结果。2和4 Gy辐射对源自BMSCs的成骨细胞分化晚期的抑制作用可能与Hes1表达水平上调有关。在辐射影响下，Runx2并不能对Notch信号通路发生抑制作用，从而解除其对成骨细胞分化的抑制作用。源自BMSCs的成骨细胞前体细胞接受2 Gy照射后，RANKL表达水平升高可能促进破骨细胞的成熟与分化。在电离辐射所导致的骨吸收增强作用中，M-CSF可能起到了非常关键的作用。M-CSF可以增强RANKL诱导破骨细胞的能力，激活破骨细胞的分化和成熟，从而导致了破骨细胞骨吸收能力的增强。
本研究发现，电离辐射对源自MC3T3-E1细胞的成骨中Notch1的表达与对于细胞分化的抑制之间并没有直接的联系。源自MC3T3-E1细胞的成骨细胞中Hes1表达水平的升高，表明2和4 Gy电离辐射后Notch信号通路被激活。电离辐射可能是通过提高Hes1的表达水平对源自MC3T3-E1细胞的成骨细胞分化晚期进行抑制。源自MC3T3-E1细胞的成骨细胞可以促进破骨细胞的增殖、分化和成熟。本研究结果有助于进一步理解在电离辐射影响下，Notch信号通路在成骨细胞分化的过程所起的作用。通过RNA干扰的方法降低NICD的表达水平后，Notch信号通路中的关键因子以及ALP、RANKL和M-CSF在电离辐射的表达水平变化的趋势发生了改变。NICD对于成骨细胞分化中起到了非常重要的作用。
电离辐射可以对破骨细胞的分化及功能产生抑制。RNA干扰使破骨细胞前体细胞对电离辐射所致的基因表达的调节发生了改变;电离辐射可能是通过Notch1和Notch3共同作用对破骨细胞前体细胞的功能产生抑制。NICD在辐射所造成的破骨细胞功能和分化的抑制中起到了重要的作用。
电离辐射;成骨细胞;破骨细胞;Notch信号通路;放射治疗;损伤机制
北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院
博士
放射医学
樊飞跃;孙元明
2013
中文
R818.023
105
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）