激活CB2R对类风湿关节炎的防治作用
研究目的:
类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)的疾病特征是关节滑膜炎症持久反复发作，导致关节内软骨和骨的破坏，最终导致关节功能障碍，甚至残疾。其主要的组织病理学特点表现为T淋巴细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes，简称FLS）等聚集致关节滑膜增生增厚。近年来研究表明，FLS在关节炎的发生发展中起着主导作用。尽管目前临床上对于RA的治疗已有很大的提高，但是依然有部分RA病人对现有的药物和治疗策略不敏感，因此对于新的治疗靶点，尤其是在炎症调节通路上新靶点的研究就显得意义重大。Ⅱ型大麻素受体(Cannabinoid receptor2，简称CB2R)主要表达在外周免疫系统中，近年来由于其显著地抗炎效果在许多疾病领域成为研究热点，包括多发性硬化症，过敏性接触性皮炎等。同时由于其激动后不产生中枢神经体统方面的副作用，因此越来越多的CB2R特异性激动剂成为基础研究和临床研究中关注的焦点。本课题的研究目的在于探究CB2R能否成为治疗RA的新靶点，特异性激动CB2R能否治疗RA，以期为临床治疗提供可靠的实验依据。
研究方法:
本研究首先用免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）、免疫荧光（Immunofluorescece，简称IF）、免疫印迹（Western blot，简称WB）和逆转录聚合酶链式反应(Revers transcription polymerase chain reaction，简称RT-PCR)等分子生物学方法在RA病人滑膜中定性研究CB2R的表达情况。利用实时定量荧光PCR(Real-time PCR)和WB检测在不同的炎性刺激下CB2R表达的调节情况。在定性研究得到肯定结果后，以胶原诱导的小鼠关节炎模型(Collagen-inducedarthritis，简称CIA)为主要的动物模型，在整体上，利用CB2R激动剂HU-308，研究CB2R被激动后是否可以有效防治实验性关节炎;从第二次免疫前一天开始（第20天开始），给于不同剂量的HU-308，连续给药七天，观察指标包括小鼠关节肿胀程度（根据炎症半定量评分标准，每隔一天记录一次）、关节组织被破坏的程度（HE染色，X-光照射和Micro-CT）及血清中抗Ⅱ型胶原抗体的表达情况（免疫酶联吸附反应，Enzeyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）。接着在原代培养的RA病人FLS细胞上，利用Real-time PCR和ELISA，分别在基因水平和蛋白水平上从炎症因子和MMPs两方面研究HU-308防治RA的细胞和分子机制，同时也研究了HU-308对FLS增殖的影响;并利用CB2R基因敲除鼠，在腹腔巨噬细胞上验证HU-308激活CB2R特异性。最后在RA病人FLS上，用WB的分子生物学方法初步探究HU-308发挥作用的信号转导方面的分子机制。
结果:
1.免疫组化结果表明在RA病人和骨关节炎(Osteroarthritis，简称OA)病人的滑膜组织中，巨噬细胞样滑膜细胞和FLS均有CB2R的表达;且相比较于OA，CB2R在RA滑膜中有表达上调的趋势。在原代培养的RA病人FLS中，IF, WB和PCR的结果也定性证明了CB2R在RA病人滑膜中的存在。另外，炎症刺激因子IL-6，TNF-α和LPS能够上调FLS中CB2R的表达。此外我们还发现，相对于正常小鼠而言，在CIA小鼠的脾脏和肝脏中，CB2R的表达也显著上调，提示在病理性炎症过程中，CB2R可能会反馈性的表达上调来发挥其抗炎作用。
2.在动物整体上，对炎症的半定量评分结果表明，1 mg/kg剂量的HU-308治疗可以有效减轻CIA小鼠的关节肿胀程度，延缓关节炎的发生发展;HE染色结果显示1 mg/kg剂量的HU-308能减少关节滑膜的病理性增厚,防治关节腔内炎性细胞的侵润;X-光片和Micro-CT结果显示1.0 mg/kg的HU-308治疗能减轻CIA小鼠关节骨和软骨的破坏程度;同时ELISA结果显示1 mg/kg治疗组中小鼠血清中抗Ⅱ型胶原抗体（包括总的IgG， IgG1， IgG2a， IgG2b）的水平明显降低。但0.3 mg/kg剂量的HU-308没有观察到明显的治疗效果。
3.在原代FLS中，HU-308能剂量依赖性地（1-10μM）从基因和蛋白水平抑制IL-1β诱导的IL-6，MMP-3，MMP-13的表达以及IL-1β诱导的FLS的增殖。
4.在原代野生型腹腔巨噬细胞中，HU-308能剂量依赖性地抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，简称LPS）诱导的腹腔巨噬细胞中IL-6和TNF-α的表达，在CB2R敲除的腹腔巨噬细胞中，HU-308的这一抑制作用被取消，表明CB2R介导了HU-308的抗炎效果。
5.信号通路的初步探究表明，有效剂量的HU-308(10μM)能够抑制IL-1β诱导的FLS中ERK1/2， p38 MAPK的磷酸化，提示HU-308在关节炎中的作用可能与上述两种信号分子介导的调节通路有关。
结论:
RA滑膜中表达CB2R，且炎症可以上调CB2R的表达;特异性激动CB2R(HU-308)可以减轻CIA小鼠关节炎症和关节肿胀程度;其可能的机制有:1、降低自身抗体的水平，2、抑制炎症因子和MMPs的表达，3、抑制滑膜成纤维细胞的增殖;ERK1/2和p38 MAPK可能参与调节了HU-308在RA中的治疗效果。
类风湿关节炎;Ⅱ型大麻素受体;特异性激动剂;防治对策;动物实验
第二军医大学
博士
药理学
苏定冯
2013
中文
R593.22
108
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）