Gremlin1在高糖环境足细胞损伤中的作用及机制研究
目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是目前世界范围内导致终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的第一位病因，增加了各国卫生保健事业的支出，严重影响患者的生存质量。糖尿病肾病临床主要表现为浮肿、蛋白尿和进行性肾功能减退;肾脏病理主要表现为结节状或弥漫性系膜细胞增殖、系膜细胞外基质积聚、系膜区增宽、基底膜(GBM)增厚，足细胞足突融合，肾小球硬化及小管间质纤维化。近年来的研究显示，肾小球滤过屏障结构和功能的改变，尤其是作为肾小球滤过屏障重要组成成分的足细胞损伤，在糖尿病肾病的进展中发挥了重要作用，与长期的、进行性加重的蛋白尿密切相关。
足细胞是一种高度特异性的终末分化的脏层上皮细胞，附着于肾小球基底膜外侧，与肾小囊壁层上皮细胞辗转延续，功能互补，参与构成肾小球滤过屏障的最外层，对蛋白质的滤过及GBM成分的更新起着举足轻重的作用。糖尿病肾病早期主要表现为足细胞的损伤，这一病损可早于系膜细胞和小管细胞数年，与临床早期持续蛋白尿相关。由于高糖环境导致足细胞损伤，使蛋白漏出增加，而蛋白尿又进一步加重足细胞的损伤，研究显示足细胞在糖尿病肾病的进展中具有重要作用，因此人们把糖尿病肾病也称之为糖尿病足细胞病。在DN的发生发展中，足细胞的病理改变主要包括足细胞数目减少，凋亡增加，流动性增强，从GBM上脱落导致GBM裸露，形成局灶粘连和肾小球硬化。但是，高糖导致足细胞损伤的具体机制尚不完全清楚，有研究显示，gremlin生发基因在糖尿病肾病时重现，调控的损伤修复反应参与了足细胞的损伤过程。
Gremlin是进化上高度保守的、分子量为23-28KD、由184个氨基酸残基构成的分泌型糖蛋白，属于骨形态蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)拮抗剂家族成员，在胚胎发育、生长和分化过程中起有重要的作用。有磷酸化和糖基化修饰，这些修饰位点介导蛋白质与蛋白质之间的相互作用。在胚胎发育时期gremlin通过调节由SHH/FGF-4(sonic hedgehog/fibroblast growth factor-4）构成的间质极化区(ZPA:zone of polarizing activity)和外胚层嵴顶点(apical ectodermal ridge)之间的反馈环路而实现对肢体发育和肺、肾分支形态的调控，随着器官的发育成熟而寂静停止;而这一反馈调节的结果是通过gremlin1对相关组织的凋亡进行时空调控实现的。在成年正常肾组织几乎无gremlin1表达，DN时表达明显增强，并与TGF-β1共定位。Gremlin1可以介导高糖培养近端小管上皮细胞表型转变，分泌大量胶原和纤连蛋白，促进间质纤维化;可以使高糖培养的肾小球系膜细胞增殖，产生大量系膜外基质(ECM)，促进系膜区扩张，造成肾小球硬化。关于gremlin是否可以引起足细胞的损伤，文献未见报道。
在早期糖尿病肾病中，足细胞损伤是引起肾小球性蛋白尿的重要原因，而gremlin1在早期DN主要表达在足细胞。足细胞标志蛋白的表达下降和足细胞的凋亡是反应足细胞损伤的主要指标。本研究拟通过高糖环境体外培养条件性永生化足细胞，探讨gremlin1在糖尿病肾小球足细胞损伤中的作用及机制，为进一步阐明糖尿病肾病的发病机制及其防治提供理论依据。
方法:
1、Gremlin1在高糖环境足细胞中的表达与分布
条件性永生化小鼠足细胞在33℃，γ-IFN存在的许可条件下培养传代后，在37℃，无γ-IFN的非许可条件下培养10-14天，促进足细胞分化成熟。应用免疫荧光化学检测F-actin以观察分化与未分化足细胞形态;应用免疫荧光化学检测synaptopodin观察足细胞成熟情况，未分化成熟的足细胞不表达synaptopodin，合格的细胞被用于实验。足细胞随机分为3组:正常对照组(NormalControl，NC)、高糖组(HighGlucose，HG)和甘露醇对照组（Manitol+GlucoseControl，MG）。NC组细胞给予D-glucose5.5mmol/L，HG组给予D-glucose30mmol/L，为了控制高渗透压对细胞实验结果的影响，MG组应用24.5mol/L甘露醇+D-glucose5.5mmol/L作为对照。各组细胞同步培养48小时后收集，应用westernblot和real-timePCR方法检测gremlin1蛋白和mRNA在高糖环境足细胞中的表达;应用激光共聚焦显微镜观察gremlin1在足细胞中的分布情况及定位特点。
2、重组gremlin1对高糖环境足细胞标志蛋白及凋亡的影响
应用重组的小鼠gremlin1细胞因子与高糖共同刺激足细胞，模仿生物体内高糖环境下gremlin1过表达的情形。①首先探讨gremlin1对高糖环境足细胞发生作用的最佳浓度和时间，即量效和时效关系实验。用高糖分别混合0、0.1、0.25、0.5、0.75、1μg/ml的gremlin1培养分化成熟的足细胞48小时，应用westernblot和real-timePCR方法，找出gremlin1对足细胞nephrin和synaptopodin负性调控最明显的浓度作为下一步应用gremlin1的浓度依据。其次应用高糖混合最佳作用浓度的gremlin1因子分别培养成熟足细胞0、6、12、24、48、72小时，找出gremlin1对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin负性调控作用的最佳时间。②在最佳gremlin1作用浓度(0.75μg/ml)和时间(48h)条件下，分别设置正常对照(NC)、高糖对照(HG)和高糖+gremlin1(HG+grem1)对照，应用激光共聚焦显微镜观察gremlin1对足细胞nephrin和synaptopodin表达和定位的影响，直观分析gremlin1对足细胞的损伤作用。③设置对照如上，应用TUNEL检测gremlin1对足细胞凋亡的影响。计数TUNEL阳性细胞数。④应用western、real-timePCR方法检测Bcl-2、Bax、Cleaved Casepase-3等凋亡相关蛋白表达，以弥补TUNEL方法缺陷，与TUNEL一起共同评价gremlin1对高糖足细胞凋亡的影响。
3、Gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞标志蛋白及凋亡的影响
分化成熟的足细胞分为高糖组(HG)、高糖+gremlin1-siRNA组(HG+grem.siRNA)和高糖+对照siRNA组(HG+con.siRNA)。①优化转染条件，找出化学合成的gremlin1-siRNA沉默gremlin1基因表达的最佳剂量。②应用激光共聚焦显微镜观察gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin表达及定位的影响，评价gremlin-siRNA对足细胞的影响。③应用westernblot和realtimePCR的方法观察gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin表达的影响。④应用TUNEL方法观察gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞凋亡的影响，并计数TUNEL阳性细胞。⑤检测gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞Bcl-2、Bax和CleavedCaspase-3等凋亡相关蛋白表达的影响，进一步印证gremlin1-siRNA对足细胞凋亡的影响。
4、介导gremlin1对高糖环境足细胞损伤的信号机制研究
①由于在DN肾组织上发现TGF-β1和gremlin1表达共定位，因此我们研究高糖环境时二者之间是否存在特定关系。将分化成熟的高糖培养的足细胞分为两组，一组高糖培养基中加入重组的gremlin1细胞因子（0.75μg/ml）共同孵育48小时，检测TGF-β1的蛋白和mRNA表达情况（HG+grem1组）;另一组采用高糖培养基中加入重组的TGF-β1细胞因子(5ng/ml)共同孵育48小时，检测gremlin1的蛋白和mRNA表达情况（HG+TGF-β1组）;另外设置正常对照组(NC)和高糖对照组(HG)分别检测gremlin1和TGF-β1的表达。②与gremlin1相关的TGF-β信号分子的检测:用高糖与重组gremlin1（0.75μg/ml）共同孵育足细胞0、15、30、60、120、240分钟后，检测smad2/3、p-smad2/3、p38、p-p38、JNK1/2、p-JNK1/2等经典与非经典TGF-β信号分子，找出与gremlin1具有时效关系的信号途径进行阻断实验研究，以期发现其中的调控机制。③上述实验结果发现TGF-β/smad2/3信号途径与gremlin1作用相关。应用TGF-β1受体阻断剂SB431542阻断TGF-β1信号，观察TGF-β1受体阻断后对gremlin1抑制的nephrin和synaptopodin蛋白表达的影响。④应用smad2/3-siRNA转染高糖和gremlin1共同培养的小鼠足细胞，48小时后收获细胞，验证smad2/3敲减效果，并检测smad2/3敲减后对gremlin1抑制的nephrin和synaptopodin蛋白表达的影响。
结果:
1、Gremlin1在高糖环境足细胞中的表达与分布
①足细胞F-actin免疫荧光染色结果显示，在33℃，γ-IFN存在的许可条件下培养，足细胞呈梭形或三角形，细胞突起较少。在37℃，无γ-IFN的非许可条件下培养10-14天后，足细胞胞体上伸出大量足突，胞浆向四周展开，呈树枝状。Synaptopodin免疫荧光染色结果显示，未分化足细胞胞浆中synaptopodin的表达几乎没有，而分化10天后的足细胞中synaptopodin的表达明显增强，提示足细胞已分化成熟。②Westernblot结果:在正常对照及甘露醇对照组，gremlin1蛋白表达很少，而HG组gremlin1表达明显上调(p＜0.01)。③Real-timePCR检测结果显示，与NC和MG对照组相比，HG组足细胞gremlinmRNA的表达水平在培养48h时明显升高(p＜0.01)。④激光共聚焦显微镜观察结果显示:gremlin1在高糖环境足细胞中的分布主要位于胞浆中，少量沿细胞膜分布。胞浆中的gremlin1蛋白主要呈斑点状或颗粒状分布;包膜上的gremlin1蛋白呈细颗粒状或线样分布。
2、重组gremlin1对高糖环境足细胞标志蛋白及凋亡的影响
①Gremlin1量效关系实验结果显示:在高糖混合0.75μtg/mlgremlin细胞因子时，nephrin和synaptopodin的蛋白和mRNA表达降低显著(p＜0.01)。②Gremlin1时效关系实验结果显示:在高糖混合0.75μg/mlgremlin作用48h时，nephrin和synaptopodin的蛋白和mRNA的表达降低显著(p＜0.01)。③Gremlin1对足细胞nephrin和synaptopodin影响的共聚焦结果显示:gremlin1可以加重高糖引起的足细胞损伤，二者表达量均较高糖组进一步下降。Nephrin分布由细胞膜为主转变为以胞浆为主，synaptopodin由斑点状沿actin细丝分布转变为团块状或核周、核内分布。这些分布结构的改变与细胞功能的变化密切相关，提示足细胞受损。④TUNEL结果显示，与HG组相比，HG+grem1组细胞凋亡发生率明显升高(p＜0.05)。⑤凋亡相关蛋白的检测结果显示:gremlin1使Bcl-2蛋白及mRNA表达较HG组进一步下降，而Bax和CleavedCaspase-3的表达较HG组进一步升高，提示gremlin1进一步加重高糖引起的足细胞凋亡。
3、Gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞标志蛋白及凋亡的影响
①Gremlin1-siRNA验证实验结果:gremlin1-siRNA能够显著敲减高糖环境足细胞gremlin1蛋白和mRNA的表达，差异显著，（p＜0.01）。证实在6孔板中以80pmol/孔转染足细胞敲减效果最好。②激光共聚焦显微镜结果显示:gremlin1-siRNA能够改善或部分恢复高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin的表达和分布。Nephrin由高糖时胞浆为主部分恢复转至胞膜，synaptopodin由高糖时的粗颗粒状、团块状恢复至沿actin细丝排列的斑点状。③Westernblot和realtimePCR实验结果显示gremlin1-siRNA可以上调高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin的蛋白及mRNA的表达。④TUNEL结果:Gremlin1-siRNA可以改善高糖诱导的足细胞凋亡，TUNEL细胞阳性率下降显著(p＜0.05)。⑤Gremlin1-siRNA对高糖环境足细胞凋亡相关蛋白的影响结果显示:gremlin-siRNA可以恢复Bcl-2蛋白和mRNA的表达，并下调Bax、CleavedCasepase-3蛋白及mRNA的表达，较高糖组差异显著(p＜0.01)。
4、介导gremlin1对高糖环境足细胞损伤的信号机制研究
①Gremlin1与TGF-β1关系研究结果显示:gremlin1与TGF-β1在高糖足细胞中可以互相诱导生成，相互促进，与高糖组比较差异显著(p＜0.05)。②与gremlin1相关的TGF-β信号分子研究结果显示:经典的TGF-β1途径信号分子smad2/3蛋白在高糖和gremlin1共培养时存在时间依赖性的磷酸化激活(p＜0.05)，而非经典途径的p38、JNK1/2信号系统在gremlin1刺激后无明显变化。说明gremlin1发挥作用可能需要经典的TGF-β1/smad2/3信号途径。③TGF-β1受体阻断实验结果显示:SB431542(5μmol/L)可以阻断gremlin1对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin蛋白表达的抑制(p＜0.01)，说明gremlin1需要内源性TGF-β1参与其活性。④Smad2/3-siRNA阻断实验结果显示:应用smad2/3-siRNA阻断TGF-β1信号可以阻断gremlin对高糖环境足细胞nephrin和synaptopodin蛋白表达的抑制(p＜0.01)，再次印证体外gremlin1发挥作用需要内源性TGF-β1的存在。
结论:
1、在高糖培养的小鼠足细胞中，gremlin1表达上调。Gremlin1蛋白主要分布在足细胞的胞浆中，少部分分布在胞膜上。胞浆部分呈颗粒状分布，包膜部分呈细颗粒状或线样排列。
2、Gremlin1加重高糖所致的nephrin和synaptopodin表达下降及分布异常，促进足细胞损伤。Gremlin1加重高糖所致的足细胞凋亡。
3、Gremlin1-siRNA治疗可以改善高糖所致的nephrin和synaptopodin表达下降和分布异常，降低高糖所致足细胞凋亡，部分恢复足细胞损伤。
4、在高糖环境足细胞中gremlin1与TGF-β1相互诱导生成，协同发挥作用。Gremlin1在高糖环境下可能通过经典的TGF-β1/smad2/3信号途径发挥足细胞损伤作用，阻断TGF-β1/smad2/3信号可以抑制gremlin1对高糖环境足细胞的损伤作用。
综上，本研究提示gremlin1在糖尿病足细胞的损伤和凋亡中发挥了作用，TGF-β1/smad2/3信号途径可能参与了这一过程。
gremlin1基因;高糖环境;足细胞损伤;RNA干扰;转化生长因子;smad蛋白
河北医科大学
博士
内科学
李英
2013
中文
R587.2;R692
125
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）