MAGe-A1和MAGe-A3在脑胶质瘤中的表达及机制
脑胶质瘤是神经系统最常见的原发性神经上皮性肿瘤，约占颅内原发肿瘤的45-50％，目前脑胶质瘤治疗方法有手术治疗、放疗和化疗，但总的治疗效果仍不理想，预后差。肿瘤免疫治疗是一种针对性更强、副作用更小的治疗，目前，它已经成为继肿瘤的手术治疗、放射治疗及化疗之后的第四种肿瘤治疗模式。肿瘤免疫治疗的兴起使得确立免疫治疗理想靶点，即，特异性肿瘤相关抗原，成为关键的前提，这要求肿瘤抗原具有以下特点:抗原在肿瘤中高表达，而在正常组织不表达或者表达具有严格限制性。
癌睾丸抗原(Cancer/testisantigen，CTA)在正常人体组织仅表达于睾丸生殖细胞和部分胎盘，而睾丸又被认为是免疫豁免器官，因此，CTA被看做是肿瘤特异性免疫治疗的理想靶点。黑色素瘤相关抗原基因（Melanoma-associatedantigengene-A，MAGE-A）是CTA的一个亚家族。近年来，因其具有更高的肿瘤特异性而成为研究热点。
近年来，导师的课题组一直致力于MAGE-A基因的研究。本次研究首先采用免疫组织化学的方法观察了MAGE-A1、MAGE-A3及MAGE-A11蛋白在脑胶质瘤组织及正常脑组织的表达情况及其与胶质瘤临床生物学指标和预后之间的关系。应用RT-PCR方法检测MAGE-A1、MAGE-A3在mRNA水平的表达，并通过MSP的方法分析了MAGE-A1、MAGE-A3启动子区甲基化情况与其基因表达的关系。在细胞水平给与DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)抑制剂及组蛋白去乙酰化酶（Histonedeacetylase，HDAC）抑制剂，观察细胞系在给药前后MAGE-A1、MAGE-A3基因表达情况，分析表观遗传学机制在MAGE-A1和MAGE-A3表达中的作用。
第一部分，MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在脑胶质瘤组织中的表达及与胶质瘤临床生物学指标之间的关系
目的:
通过检测MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11在脑胶质瘤组织和正常脑组织中的表达水平，研究三种蛋白表达与胶质瘤临床生物学指标和预后之间的关系。
方法:
应用免疫组织化学的方法检测MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11蛋白在脑胶质瘤组织和正常脑组织中的表达水平，并分析三种抗原蛋白与胶质瘤临床生物学指标（包括患者年龄、性别、临床病理分级、KPS评分及ki-67指数）之间的关系，且通过病例随访，分析MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11蛋白与脑胶质瘤患者预后之间的关系。
结果:
1、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在正常睾丸组织中的表达
在正常睾丸组织中，MAGE-A1主要位于初级精母细胞和精原细胞的细胞浆和细胞膜;MAGE-A3和-A11主要位于睾丸组织初级精母细胞和精原细胞的细胞浆和细胞核。
2、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在脑胶质瘤组织及正常脑组织中的表达
正常脑组织中，没有MAGE-A1、-A3和-A11蛋白的表达。MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在脑胶质瘤中的高表达率（指的是2+～3+）分别为64.1％、51.2％和57.6％。MAGE-A1(P=0.000)和MAGE-A11(P=0.000)蛋白的表达在低级别胶质瘤和高级别胶质瘤之间有显著性差异，且随着病理级别的升高而增加，而MAGE-A3(P=0.958)蛋白则在各病理级别间没有显著性差异。在高级别脑胶质瘤（Ⅲ～Ⅳ级），MAGE-A1蛋白主要表达于肿瘤细胞的胞浆，而MAGE-A3和MAGE-A11蛋白则主要表达于胶质瘤细胞的胞浆和胞核;在低级别脑胶质瘤（Ⅰ～Ⅱ级），MAGE-A1蛋白主要表达于肿瘤细胞的胞浆和胞膜，而MAGE-A3和MAGE-A11蛋白则主要表达于胶质瘤细胞的胞浆和胞核。
3、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在脑胶质瘤的表达与临床病例资料之间的关系
MAGE-A1蛋白表达与患者的年龄（x2=1.651，P=0.199）、性别(x2=0.163，P=0.686)、KPS评分（x2=0.060，P=0.806）之间均无相关性，而与病理级别（x2=25.714，P=0.000）有显著相关性，随着病理级别的增高，MAGE-A1蛋白表达增加。
MAGE-A3蛋白表达与患者的年龄（x2=0.195，P=0.658）、性别（x2=0.778，P=0.378）、病理级别(x2=0.159，P=0.690)之间均无相关性，而与KPS评分(x2=13.637，P=0.000)有显著相关性。
MAGE-A11蛋白表达与患者的年龄（x2=0.382，P=0.537）、性别（x2=0.000，P=0.986）、KPS评分（x2=0.209，P=0.648）之间均无相关性，而与病理级别（x2=4.718，P=0.030)有显著相关性，随着病理级别的增高，MAGE-A11蛋白表达增加。
4、MAGE-A1，-A3，-A11蛋白在脑胶质瘤的表达与ki-67指数(ki-67index，ki-67LI)之间的关系
MAGE-A1(x2=4.965,P=0.026)和MAGE-A11蛋白(x2=7.123,P=0.008)与ki-67LI有显著相关性，而MAGE-A3（x2=2.224，P=0.136）则与ki-67LI无显著相关性。
5、MAGE-A1、-A3和-A11蛋白在脑胶质瘤的表达与临床预后之间的关系
MAGE-A1和MAGE-A11蛋白高表达组的总生存期较MAGE-A1（P=0.005）和MAGE-A11（P=0.019）低表达组短，差异有显著性;MAGE-A3（P=0.304）高表达组总生存期与低表达组无显著性差异。log-rank单因素分析显示，病理级别、KPS评分、年龄、ki-67LI、MAGE-A1和MAGE-A11蛋白表达水平与患者的预后相关。进一步进行Cox's回归分析，得出病理级别、KPS评分、MAGE-A1和MAGE-A11蛋白表达水平与患者的预后相关。
结论:
1、MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A11蛋白具有相对的肿瘤特异性，可以作为理想的肿瘤免疫治疗靶点。
2、MAGE-A1和MAGE-A11可能与胶质瘤细胞的增殖有关。
3、MAGE-A1、MAGE-A11蛋白、病理级别和KPS评分可以作为判断胶质瘤预后的指标。
第二部分，MAGE-A1和MAGE-A3在脑胶质瘤中mRNA水平的表达及DNA甲基化状态分析
目的:
检测MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表达及MAGE-A1和MAGE-A3启动子区甲基化状态，分析启动子区甲基化与mRNA及蛋白表达的关系，并分析rnRNA表达及启动子区甲基化与临床病例特点之间的关系。
方法:
应用RT-PCR的方法在脑胶质瘤组织中检测了MAGE-A1和MAGE-A3在mRNA水平的表达，并分析它们蛋白表达及患者预后之间的关系，应用MSP技术分析MAGE-A1和MAGE-A3启动子区的甲基化状态，分析两者的mRNA、蛋白表达与启动子区甲基化之间的关系以及MAGE-A1和MAGE-A3启动子区甲基化与临床生物学特征之间的关系。
结果:
1、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA在正常脑组织及胶质瘤组织中的表达
正常脑组织中均未发现MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表达。胶质瘤组织中MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表达阳性率分别为65.4％和38.5％;两者同时表达阳性的有21例，占26.9％，仅有一个表达阳性的有60例，占76.9％，两者都不表达的为18例，占23.1％。
2、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表达与胶质瘤患者生存期之间的关系
MAGE-A1mRNA阳性表达组的总生存期较阴性表达组短(P=0.046)，差异有显著性，MAGE-A3阳性表达组总生存期与阴性表达组之间无显著性差异(P=0.797)。
3、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA的表达与蛋白表达之间的关系
MAGE-A1(r=0.402,P=0.000)和MAGE-A3(r=0.242,P=0.033)的mRNA与蛋白表达之间呈正相关;但mRNA与蛋白的表达并非完全以一一对应。
4、MAGE-A1和MAGE-A3启动子区去甲基化状态
MAGE-A1基因在正常脑组织和胶质瘤组织中的去甲基化率分别为0％(0/15)、64.1％(50/78)，两者之间差异有显著性(x2=20.796，P=0.000)。MAGE-A3基因在正常脑组织和胶质瘤组织中的去甲基化率分别为0％(0/15)和41％(32/78)，两者之间差异有显著性（x2=9.382，P=0.002）
5、MAGE-A1和MAGE-A3基因的去甲基化状态与它们的基因及蛋白表达之间的关系
MAGE-A1基因启动子区去甲基化的脑胶质瘤组织其mRNA表达水平显著高于发生甲基化的胶质瘤组织(0.1414±0.0690vs.0.0317±0.0066，P=0.000)。MAGE-A1基因启动子区去甲基化与其在mRNA(x2=37.289，P=0.000)水平上的表达及在蛋白(x2=14.736，P=0.000)水平上的表达均有显著的相关性。MAGE-A3基因启动子区去甲基化的脑胶质瘤组织其mRNA表达水平显著高于发生甲基化的胶质瘤组织(0.0666±0.0065vs.0.0071±0.0026，P=0.000)。MAGE-A3基因启动子区去甲基化与MAGE-A3mRNA水平上的表达有显著的相关性(x2=36.066，P=0.000)而与其在蛋白水平上的表达无明显的相关性(x2=1.697，P=0.193)。但MAGE-A1和MAGE-A3基因启动子区的去甲基化与其mRNA表达之间并非完全一一对应。
6、MAGE-A1和MAGE-A3基因的去甲基化状态与临床生物学特征之间的关系
MAGE-A1基因的去甲基化状态与患者性别(x2=0.778，P=0.378)、KPS评分(x2=0.060，P=0.806)之间无显著相关性，与年龄(x2=7.306，P=0.007)和病理级别(x2=14.286，P=0.003)有显著相关性，低级别胶质瘤MAGE-A1基因发生去甲基化频率显著低于高级别胶质瘤。MAGE-A1启动子区去甲基化组的总生存期较甲基化组短，但差异无显著性(P=0.179)。MAGE-A3基因的去甲基化状态与患者年龄(x2=0.1.009，P=0.315)、KPS评分(x2=0.102，P=0.749)、性别(x2=0.464，P=0.496)及病理级别(x2=3.367，P=0.338)均无相关性。MAGE-A3启动子区去甲基化组的总生存期较甲基化组短，但差异无显著性(P=0.201)。
结论:
1、正常脑组织中无MAGE-A1和MAGE-A3mRNA的表达，而在大部分胶质瘤组织中有两者的表达，这表明两者可以作为免疫治疗的理想靶点。
2、MAGE-A1的mRNA表达水平可以作为判断临床预后的一个指标。
3、MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表达水平与蛋白表达水平之间呈正相关，但蛋白与mRNA的表达并不完全对应，蛋白表达高率于mRNA表达率，考虑与抗体在不同MAGE-A家族成员之间有交叉反应所致。
4、MAGE-A1和MAGE-A3基因在正常脑组织均无启动子区去甲基化，而在大部分胶质瘤组织存在启动子区去甲基化。
5、DNA去甲基化是MAGE-A1和MAGE-A3表达的机制之一，但是两者表达可能除此以外还有其他机制在起作用。
6、MAGE-A1和MAGE-A3启动子区甲基化状态不能作为判断预后的指标。
第三部分，MAGE-A1和MAGE-A3在脑胶质瘤细胞株的表达及DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态的检测
目的:
对胶质瘤细胞系U87和U251给予DNMT抑制剂:5-aza-CdR和HDAC抑制剂:TSA单独或联合刺激，观察给药前后MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表达情况，以进一步说明两个基因表达的机制。
方法:
对两种细胞分别给予5-aza-CdR浓度为0、2.5μmol/l、5μmol/l和/或TSA浓度为0、0.5μmol/l、1μmol/l药物刺激72小时，然后，更换新鲜不含这两种药物的培基，培养48小时，收集细胞，提取RNA，以RT-PCR的方法检测给药刺激前后的MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表达量。试验中，我们将5-aza-CdR浓度均为0μmol/l，TSA浓度分别为0、0.5、1μmol/l的细胞定为第1～3组，5-aza-CdR为2.5μmol/l，TSA浓度分别为0、0.5、1μmol/l的细胞定为第4～6组，5-aza-CdR为5μmol/l，TSA浓度分别为0、0.5、1μmol/l的细胞定为第7～9组。
结果:
1、MAGE-A1和MAGE-A3在U87细胞和U251细胞的表达
在未给与药物处理时，U87细胞无MAGE-A1和MAGE-A3的表达，U251细胞有少量MAGE-A1（0.0553±0.001）和极少量MAGE-A3（0.0027±0.0003）表达。
2、U87药物处理后MAGE-A1和MAGE-A3的变化
通过RT-PCR检测MAGE-A1和MAGE-A3mRNA在U87的表达情况，在第1～3组中，两个表达均为阴性，在第4～6组细胞中，两者较第1～3组表达高，且随着TSA浓度的增强逐渐增强，在第7～9组细胞中，两者的表达较第4～6组高，且随着TSA浓度的增强逐渐增强。析因分析，单用5-aza-CdR、单用TSA以及联合应用两者后，MAGE-A1和MAGE-A3的表达之间均有显著性差异，TSA三个不同浓度即0、0.5、1μmol/l及5-aza-CdR三个不同浓度即0、2.5、5μmol/l对两个基因表达的影响之间均有显著性差异，其中，5-aza-CdR浓度为5μmol/l联合TSA浓度为1μmol/l，两者表达量最高，这提示:在U87细胞单独给予HDAC抑制剂不能引起MAGE-A1和MAGE-A3基因的表达激活，单独给予5-aza-CdR或与TSA合用可以引起两个基因的表达激活，且两者合用的作用好于单独给药，两者有协同作用。
3、U251药物处理前后MAGE-A1和MAGE-A3的变化。
在第1～3组，MAGE-A1和MAGE-A3均有少量表达，在第4～6组细胞中，两者的表达较第1～3组表达量高，且随着TSA浓度的增高逐渐增强，在第7～9组细胞中，两者的表达较第4～6组高，且随着TSA浓度的增高逐渐增。析因分析显示，单用5-aza-CdR、单用TSA以及联合应用两种药物，两者表达之间均有显著性差异，其中，5-aza-CdR浓度为5μmol/l联合TSA浓度为1μmol/l，两者表达量最高，这提示:单独给予HDAC抑制剂不能引起MAGE-A1和MAGE-A3mRNA的表达增加，单独给予5-aza-CdR或与TSA合用可以引起MAGE-A1和MAGE-A3mRNA表达增加，且两药合用的作用好于单独给药，两药有协同作用。
结论:
MAGE-A1和MAGE-A3基因的表达机制不仅包括DNA启动子区甲基化，还包括组蛋白乙酰化，其中以DNA甲基化占主导地位。
脑胶质瘤;黑色素瘤相关抗原基因;免疫组化;表观遗传学;基因表达
河北医科大学
博士
免疫学
单保恩
2013
中文
R739.41
129
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）