A族链球菌上调巨噬细胞负调节因子A20表达的菌体成分以及作用机制研究
目的:
A群链球菌(GroupAstreptococcus，GAS)是常见的人类致病菌，能够引起各种化脓性感染性疾病，包括咽炎、扁桃体炎等轻型感染，以及感染后的自身免疫病、致死率很高的毒素性疾病，如风湿热、风湿性心脏病、免疫性脑病、牛皮癣、肾小球肾炎以及毒性休克综合征、猩红热等，严重威胁人体健康。机体试图利用免疫防御功能清除细菌，阻断感染，但由于链球菌有强大的免疫逃逸能力，所以链球菌感染表现为迁延及反复感染状态。目前，研究表明GAS的免疫逃逸表现在多方面，一方面是细菌依靠本身的毒力因子，包括M蛋白、Fba、SpeB等因素进行免疫逃逸;另一方面是GAS通过与宿主的相互作用，消弱或抑制宿主免疫防御功能而进行免疫逃逸。固有免疫是机体的第一道防线，是特异性免疫的基础，巨噬细胞是一类重要的执行固有免疫的细胞，它以模式识别受体识别、结合细菌的病原相关分子模式，通过信号传导通路致细胞活化，以多种机制杀死和清除细菌。而GAS在免疫逃逸过程中进化出各种策略，挑战固有免疫细胞的清除作用，上调宿主细胞免疫负调节因子就是其免疫逃逸的重要手段之一。NF-κB通路是巨噬细胞激活的重要通路，调节此通路的的免疫抑制分子有多种，如MyD88s、SHIP1、RP105、IRAK-MTollip、A20、TRAILR、SOCS-1、NOD2、C5a、Stlr、SIGIRR和RIP3等，这些分子的调控机制各不相同，但最终都能对NF-κB信号通路起负调节作用。本室前期工作已证实，GAS可以诱导鼠巨噬细胞(MΦ)产生高水平的免疫负调节因子A20，本研究在此基础上聚焦于上调A20表达的GAS菌体成分以及作用机制的研究。
A20为锌指蛋白，又称为肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumornecrosisfactoralphainducedprotein3，TNFAIP3)，也称作肿瘤坏死因子α诱导蛋白A20(tumornecrosisfactor,alphainducedproteina20，TNFAIPA20)。作为负调控因子，A20能在多种组织细胞内诱导表达，表达刺激因素包括细胞因子如肿瘤坏死因子、IL-1、CD40等，其他还有佛波醇酯、过氧化氢、细菌和病毒以及它们的代谢产物脂多糖、EB病毒潜伏膜蛋白1等。A20的调节作用表现为对TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、细胞间黏附分子等多种促炎因子的过度释放以及对细胞凋亡和坏死明显的抑制作用。
A20在发挥调控功能时主要利用其双重泛素化酶功能，使胞浆中相关信号通路的多种关键蛋白分子泛素化，进而被蛋白酶体识别，加速降解，达到抑制信号通路的作用，抑制促炎因子的表达，增加抗炎因子的表达。在NF-κB信号通路中，A20靶向关键的上游成分，如RIP1和TRAF6，使它们泛素化降解，最终引起炎症通路的抑制。本室前期工作虽已证实GAS与MΦ作用后上调表达A20，但A20的表达变化特征如何？何为诱导A20表达的GAS相关成分？为解释这些问题，本课题进行了以下一些探索，首先观察GAS作用于RAW264.7细胞致A20表达的特征，再通过构建M蛋白和SpeB基因缺失菌分析上调A20表达致免疫逃逸的菌体成分，并通过相应的通路分析初步探索A20调控的机制。
方法:
1、检测GAS作用于RAW264.7细胞致A20蛋白表达特征:用3个不同浓度的GAS菌(MOI=10∶1、50∶1、100∶1)感染RAW264.7细胞，设感染后0.5h、2h、4h、6h、8h、12h刺激孔，行Westernblot检测不同浓度GAS菌作用于RAW264.7细胞A20蛋白表达动态变化特征。
2、GAS致RAW264.7细胞A20表达机制研究:
2.1、Real-timePCR和免疫组化法检测GAS刺激RAW264.7细胞后，炎症因子TNF-αmRNA和蛋白的表达变化。
2.2、用放线菌酮阻断后再行GAS刺激RAW264.7细胞，免疫组化法检测TNF-α，Westernblot法检测A20。
2.3、用TNFR1抗体阻断后再行GAS刺激RAW264.7细胞，Westernblot检测A20蛋白的表达变化。
2.4、Westernblot检测基因敲除鼠MyD88-BMDM细胞受GAS刺激后A20的表达变化。
3、构建SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突变菌:先构建重组同源片段自杀质粒pFW5/△SpeB和pFW5/△M,再经电转化构建基因突变菌SpeB-/-GAS、M-/-GAS并鉴定。
4、GAS基因突变菌与野生菌作用于RAW264.7细胞致A20及NF-κB通路相关分子的表达差异分析:
4.1、wtGAS、SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突变菌作用于RAW264.7细胞后，分别用Real-timePCR和Westernblot检测A20mRNA与蛋白表达。
4.2、Westernblot检测wtGAS、SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突变菌作用于RAW264.7细胞后，NF-κB通路分子TRAF6和P65的表达差异。
4.3、Real-timePCR方法分析SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突变菌与wtGAS作用于RAW264.7细胞后，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达差异。
5、Westernblot检测wtGAS、SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突变菌作用于小鼠BMDM细胞，A20及其调控的NF-κB通路中TRAF6和P65的表达差异。
结果:
1、GAS菌作用于RAW264.7细胞致A20蛋白表达的特征:低浓度菌量(MOI=10∶1)感染时，RAW264.7细胞的A20表达量从感染后2h直至12h维持高水平。中浓度(MOI=50∶1)感染，表达高峰在感染后6h，比低浓度出现晚且维持时间短。高浓度(MOI=100∶1)感染，A20的表达量在2h内虽然有所上升，但表达水平低。
2、A20表达与TN-α通路的关系:Real-timePCR检测显示RAW264.7细胞感染GAS后TNF-α的表达水平随时间变化逐渐增强（p＜0.05）;放线菌酮阻断RAW264.7细胞后再感染GAS菌，TNF-α能被有效阻断;放线菌酮阻断RAW264.7细胞后，在GAS菌刺激下A20蛋白表达明显减少，说明A20是炎症因子依赖性表达。进一步以TNFR1抗体阻断RAW264.7细胞，接受GAS刺激后A20蛋白表达明显低于阳性对照组，但高于正常对照组，提示TNFR1活化通路可以部分诱导A20。
3、MyD88基因敲除鼠的BMDM细胞在GAS菌刺激下，Westernblot检测A20蛋白无表达，提示GAS致巨噬细胞A20表达为MyD88依赖性。
4、成功构建了pFW5/△SpeB与pFW5/△M重组自杀质粒，经电转化GAS菌构建了SpeB-/-GAS、M-/-GAS基因突变菌并通过了鉴定。用M-/-GAS基因突变菌作用于RAW264.7细胞后，分别用Real-timePCR和Westernblot检测A20mRNA与蛋白表达，与野生菌GAS（wtGAS）作用相比，M-/-GAS使RAW264.7细胞A20mRNA(p＜0.01)与蛋白表达均下降，而SpeB-/-GAS使RAW264.7细胞A20mRNA(p＜0.01)与蛋白表达呈上升趋势。
5、不同菌株(wtGAS、M-/-GAS、SpeB-/-GAS)致RAW264.7细胞A20表达变化过程中，A20作用通路内相应信号分子表达的变化:用wtGAS、M-/-GAS、SpeB-/-GAS分别刺激RAW264.7细胞后在1h、2h、4h、6h、8h几个时间点动态观察底物TRAF6及其下游P65蛋白表达，发现各组内TRAF6及P65随时间进展表达均增加，说明不论成分缺失与否，炎症反应随着时间变化逐渐增强。与wtGAS刺激组对比，M-/-GAS刺激组的TRAF6及P65表达处于较高水平，而SpeB-/-GAS基因缺失菌TRAF6及P65表达则减少，与缺失菌刺激A20变化吻合。
6、不同菌株(wtGAS、M-/-GAS、SpeB-/-GAS)作用于RAW264.7细胞后，细胞因子的表达变化。用M-/-GAS、SpeB-/-GAS作用于RAW264.7细胞后，Real-timePCR检测细胞因子表达:与wtGAS作用比较，M-/-GAS刺激组IL-1β、IL-6mRNA水平明显高于wtGAS刺激组(p＜0.01)，有显著差异;TNF-αmRNA的表达水平则比wtGAS刺激组低。而SpeB-/-GAS刺激组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达与wtGAS刺激组接近。经细胞因子的表达变化趋势分析，发现细胞因子变化与相应组A20的表达一致，呈负相关。
7、不同菌株(wtGAS、M-/-GAS、SpeB-/-GAS)致鼠源BMDM细胞的A20及TRAF6、P65蛋白表达差异。分别行Westernblot检测分析，在2h、4h、6h几个时间点动态观察A20及TRAF6、P65蛋白表达差异，与野生菌刺激组相比，各组BMDM细胞的A20及TRAF6、P65蛋白表达特性及趋势与RAW264.7细胞相同。
结论:
1、放线菌酮阻断实验证明A20表达为细胞因子依赖性。TNFR1抗体阻断实验证明A20表达部分依赖TNFR1途径。
2、A20诱导表达为MyD88依赖性。
3、M蛋白能促使A20的表达，有助于GAS免疫逃逸;而SpeB则没有此功能。TRAF6及P65检测、细胞因子检测、GAS感染BMDM细胞实验均支持以上结论。
A群链球菌;锌指蛋白;巨噬细胞;负反馈调节;信号通路;菌体成分
河北医科大学
博士
免疫学
魏林
2013
中文
R392
121
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）