Notch信号通路在糖尿病肾病足细胞损伤中的研究
目的:
糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病的常见并发症，是引起终末期慢性肾功能衰竭的主要原因之一。DN的发病机制非常复杂，糖脂代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激反应及多种细胞因子等是其主要起始因素。在这些起始因素的下游，又有多条信号传导通路在其中发挥着重要作用。近年来发现Notch信号通路在DN的发生、发展过程中起着重要作用。
已有研究表明，Notch通路决定胚胎发育、细胞增殖和分化，在胚胎后肾形成过程中对足细胞和肾小管的分化中起着重要的作用。近年来在肾脏疾病领域的研究证实，Notch信号通路与糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化、肾病综合症等多种肾小球疾病有关，参与肾小球硬化的发生。在哺乳动物体内Notch信号通路有四种受体和五种配体，其中受体为Notch1-Notch4，配体分别为Jagged1、Jagged2、Delta样配体(Dll)1、Dll3和Dll4。配体与Notch受体的结合导致受体构象发生改变，随后在γ-分泌酶(γ-secretase)的介导下发生蛋白水解作用，释放出Notch胞内域（Notchintracellulardomain，NICD），NICD转移至细胞核内，活化Hes1和Hey1等分化拮抗基因的转录，阻碍分化效应基因的表达，影响细胞的分化、增殖和凋亡。
既往研究认为，DN的主要病理特征是肾小球基底膜(glomerularbasementmembrane,GBM)增厚、细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)堆积、肾小球硬化、肾小管萎缩及肾间质纤维化。近年研究发现，足细胞损伤在DN发生、发展过程中起重要作用。足细胞是终末分化的肾小球上皮细胞，它附着在GBM外侧，是肾小球滤过膜的重要组成部分。由于足细胞是高度分化细胞，增殖能力较差，当足细胞受到损伤时，Nephrin和Podocin等足细胞相关蛋白在足细胞裂孔膜(slitdiaphragm，SD)丢失，使肾小球滤过电荷屏障减弱，促进蛋白尿的发生。足盂蛋白(podocalyxin，PCX)是足突顶膜区主要的带负电荷跨膜蛋白，当足细胞损伤后PCX表达减少，破坏了足突间的排斥作用使之发生粘附、融合，导致足细胞易于脱落。现已知主要的凋亡通路有Bcl-2、p53、NF-κB等，在DN发生时，足细胞内的这些凋亡通路可被激活，诱导足细胞凋亡。同时受损的足细胞对ECM生成的调节作用发生紊乱，转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)等促进基质生成的因素增加，造成Ⅳ型胶原等基膜样基质增加，导致肾小球硬化，加速DN的进展。
许多学者通过不同方法证实了Notch信号通路在足细胞分化中的作用，Cheng等使用γ-分泌酶抑制剂(γ-secretaseinhibitor，GSI)抑制小鼠后肾形成过程中Notch通路的活化，发现近端小管细胞和肾小球中足细胞的形成明显减少，而伴随非上皮细胞的增多。如果在足细胞发育过程中出现异常Notch通路的活化，可抑制足细胞的终末分化，引起小鼠肾小球硬化。我们通过收集临床糖尿病肾病标本、建立糖尿病小鼠模型及足细胞高糖(highglucose，HG)培养，检测Notch信号通路家族成员(Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1及Hey1)的表达情况，并通过应用血管紧张素Ⅱ1受体阻断剂(angiotensinⅡtype1receptorantagonism，AT1Ra)、基因干扰技术及Notch信号通路抑制剂(GSI)抑制Notch通路，来观察是否Notch信号通路参与DN时的足细胞损伤，促进足细胞凋亡和细胞外基质沉积，为糖尿病肾病的治疗提供一条新的思路。
方法:
1、糖尿病肾病患者肾组织中Notch信号通路检测
收集2010年10月～2012年10月在河北医科大学第三医院经病史、临床检查及肾穿刺活检病理诊断为糖尿病肾病患者34例(diabeticnephropathygroup)，既往无其它肾脏病史，以10例肾肿瘤患者远离肿瘤的瘤旁组织做为对照组（controlgroup）。留取血和尿标本检测血糖(Glu)、糖化血红蛋白(HbA1)、24小时尿蛋白定量（UPE）、肌酐(Scr)、估算肾小球滤过率(eGFR);采用免疫组织化学检测Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1及Hey1蛋白表达。
2、Notch信号通路在糖尿病小鼠肾组织中的作用
雄性CD-1小鼠随机分为3组:对照组（controlgroup）、糖尿病组（diabeticgroup）、糖尿病+缬沙坦组（diabetic+Valsartangroup）。糖尿病模型小鼠腹腔单次注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，150mg/kg)，对照组只注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液，72小时后测定血糖和尿糖，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值+++～++++者确定为糖尿病模型成功。糖尿病+缬沙坦组小鼠在糖尿病模型建立后，以缬沙坦(40mg/kg)灌胃，对照组和糖尿病组以等体积蒸馏水灌胃。分别于成模后1、2、4、8周每组取6只小鼠，收集血液及24小时尿液，用于生化指标检测，ELISA方法检测尿液PCX的含量;切取肾脏4％中性甲醛固定用于组织化学、TUNEL及免疫组织化学染色;取部分肾皮质组织置于4％戊二醛用于电镜观察;部分肾皮质组织用于提取蛋白及RNA，Westernblot检测Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleavedCaspase-3、p-p53及p53蛋白表达，Real-timePCR检测Jagged1、Notch1、Hes1及Hey1mRNA表达;另取部分肾皮质组织于70％酒精固定，用于流式细胞术检测细胞凋亡率。
3、高糖对小鼠足细胞Notch信号通路的作用
小鼠足细胞在5％CO2，33℃CO2培养箱中，以含有10％胎牛血清及γ-干扰素(10U/ml)的RPMI1640培养液培养细胞使其增殖，传代后更换为不含γ-干扰素的RPMI1640培养液，置入5％CO2，37℃CO2培养箱中培养10～14天，促进细胞分化成熟。将实验细胞分成7组:正常糖对照组（5.5mmol/Lglucose，NG）、正常糖+高渗对照组(5.5mmol/Lglucose+24.5mmol/Lmannitol,NM)、高糖组(30mmol/Lglucose,HG)、高糖+阴性质粒组（30mmol/Lglucose+sh-Scramble，HG+C）、高糖+sh-Jagged1质粒组（30mmol/Lglucose+sh-Jagged1，HG+J1）、高糖+sh-Notch1质粒组(30mmol/Lglucose+sh-Notch1，HG+N1)、高糖+GSI组(30mmol/Lglucose+1μmol/LGSI，HG+GSI)。分别经细胞同步化、分组干预刺激0、12、24、48、72小时后收集细胞，免疫细胞化学检测Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1和Hey1蛋白表达;Westernblot检测Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleavedCaspase-3、p-p53及p53蛋白表达;Real-timePCR检测Jagged1、Notch1、Hes1及Hey1mRNA表达;TUNEL和AnnexinV/PI染色检测足细胞凋亡率。
结果:
1、糖尿病肾病患者临床病理表现及Notch信号通路检测
①光镜下观察，对照组肾小球、肾小管及肾间质未见明显异常;糖尿病肾病组肾小球体积增大，基底膜弥漫或不规则增厚，细胞外基质增多，K-W结节形成，部分肾小管上皮细胞出现空泡变性，间质纤维化。②糖尿病肾病组空腹血糖、糖化血红蛋白、尿蛋白量、肌酐较对照组均明显增多，而肾小球滤过率糖尿病肾病组患者比对照组下降。③免疫组化显示Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1及Hey1在肾小球及肾小管均有表达，糖尿病肾病组较对照组表达增多。
2、糖尿病小鼠肾组织Notch信号通路的表达及缬沙坦对Notch信号通路和足细胞损伤的影响
①光镜及电镜下观察，糖尿病组小鼠轻微肾小球体积增大，系膜基质增多，基底膜不规则增厚，足细胞数量减少，足突融合，部分肾小管上皮细胞出现空泡变性。②与对照组相比，糖尿病组小鼠尿蛋白(Upro)从2周开始明显升高，随病程延长呈逐渐升高的趋势;糖尿病小鼠血糖(Glu)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)比对照组小鼠增加，随病程延长呈逐渐升高的趋势;与对照组相比，糖尿病组小鼠尿蛋白和尿PCX含量明显升高，给予缬沙坦治疗后尿蛋白和PCX含量降低。③免疫组化结果显示Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1和Hey1在对照组肾小球及肾小管有少量表达，在糖尿病组表达明显增加;Westernblot检测显示，与对照组比较，糖尿病组小鼠肾组织中Jagged1、NICD1、Hes1及Hey1从1周时开始升高，表达最高点在4周，8周时略有下降;Notch1蛋白在糖尿病组比对照组表达增加，在糖尿病组各周次间表达无明显差异;糖尿病组Jagged1、Notch1、Hes1和Hey1mRNA水平与对照组相比表达增加，最高点在2周，随后下降。④Westernblot和Real-timePCR显示，糖尿病组小鼠肾小球组织Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1和Hey1蛋白及Jagged1、Notch1、Hes1和Hey1mRNA水平与对照组相比增加，给予缬沙坦治疗后降低。⑤TUNEL染色显示在糖尿病组小鼠肾组织中观察到凋亡细胞;Bax、p-p53及cleavedCaspase-3蛋白在糖尿病组小鼠肾小球组织中表达比对照组增加，给予缬沙坦治疗后降低;Bcl-2蛋白表达水平糖尿病组较对照组降低，给予缬沙坦后表达升高;p53蛋白在各组间表达无明显差异;流式细胞术显示糖尿病组小鼠肾小球内细胞凋亡增加，糖尿病+缬沙坦组降低，但仍高于对照组。
3、足细胞体外高糖培养对Notch信号通路表达及足细胞损伤的影响
①免疫细胞化学显示，Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1和Hey1在正常糖对照组足细胞中有少量表达，给予高糖刺激后表达量明显增加;Westernblot检测显示，Jagged1和NICD1蛋白在高糖刺激足细胞12小时升高，48小时表达最高，72小时略有下降;Notch1蛋白在高糖刺激后其它时间点的表达量是高糖刺激0小时表达量的2倍，高糖刺激12～72小时足细胞中Notch1蛋白水平表达无明显差异;Hes1蛋白在高糖刺激24小时升高，48小时达到项点，72小时有所降低;Hey1表达在高糖刺激12和24小时升高，然后随着刺激时间延长表达下降;高糖刺激呈时间依赖性引起Jagged1、Notch1和Hes1mRNA升高，最高峰在48小时;Hey1mRNA最高点在高糖刺激24小时，随后随着刺激时间延长而下降。②Westernblot和Real-timePCR检测发现，高糖刺激引起Jaggedl、Notch1、NICD1、Hes1、Hey1蛋白及Jagged1、Notch1、Hes1、Hey1mRNA表达增加，sh-Jagged1和sh-Notch1转染足细胞后表达下降，GSI可抑制足细胞NICD1、Hes1、Hey1蛋白及Hes1、Hey1mRNA在高糖刺激后的过表达现象，但Jagged1、Notch1蛋白及mRNA在高糖+GSI组和高糖组之间无明显差异。③Westernblot检测发现高糖呈时间依赖性刺激Bax蛋白表达，12小时开始增加，72小时达到最高点，而Bcl-2蛋白在高糖刺激后表达逐渐下降，最低点在72小时;cleavedCaspase-3在高糖刺激12小时开始增加，24小时为最高点，之后逐渐减少;p-p53蛋白在高糖刺激下表达逐渐增加，最高点在72小时;p53蛋白在高糖刺激各时间点之间表达无明显差异。④足细胞高糖培养并应用GSI或sh-Jagged1、sh-Notch1质粒转染后发现Bax、p-p53及cleavedCaspase-3蛋白较高糖组表达下降，但较正常糖对照组表达仍高，而Bcl-2蛋白较高糖组表达增强，但较正常糖对照组表达仍低，p53蛋白在各组间表达无明显差异。⑤TUNEL荧光染色及AnnexinV/PI染色显示高糖组较正常糖对照组细胞凋亡率升高，转染组及高糖+GSI组细胞凋亡率比高糖组降低。
结论:
1、在糖尿病肾病患者肾组织、糖尿病小鼠肾组织、高糖培养足细胞中发现Notch信号通路成员有过表达现象，提示Notch通路在糖尿病肾病足细胞中激活并可能参与足细胞损伤过程。
2、缬沙坦抑制糖尿病小鼠肾组织中Notch信号通路的活化，同时抑制蛋白尿和足细胞脱落，抑制凋亡相关蛋白表达，减少细胞凋亡，抑制肾小球内细胞外基质沉积。提示缬沙坦可通过抑制Notch信号通路来产生对糖尿病肾病的治疗效果。
3、在高糖培养的足细胞中，应用Notch信号通路干扰质粒及抑制剂抑制Notch信号通路的活化后，可抑制凋亡相关蛋白表达，减少足细胞凋亡。提示Notch信号通路参与高糖诱导的足细胞损伤。
糖尿病肾病;Notch信号通路;足细胞损伤;细胞凋亡;胞外基质沉积
河北医科大学
博士
病理学与病理生理学
段惠军
2013
中文
R587.2;R692
111
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）