杂色曲霉素对永生化和原代培养人食管上皮细胞DNA损伤作用及细胞周期影响的研究
杂色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)是由杂色曲霉、构巢曲霉等真菌所产生的一种具有致癌性的真菌毒素，其污染非常普遍，广泛存在于小麦、玉米、豆类等粮食作物和面包、奶酪等食品中。此外，ST在环境中的污染也比较常见，有学者发现在潮湿房屋的地毯上和建筑材料中可以检出ST的污染。目前研究表明，ST可引起多种器官的损伤及致癌作用，国际癌症研究中心已将ST列为“可能的人类致癌物”。因此，ST暴露对机体的影响是值得关注的一个公共卫生问题。
河北省南部太行山区是世界食管癌高发区之一，本课题组对河北省食管癌高发区居民饮食中真菌及其毒素污染状况进行了多年的监测分析，发现当地居民饮食中真菌毒素的污染很严重，其中ST是主要污染霉菌毒素之一，其污染率高达60.25％，平均含量达9.14μg/kg。前期的动物实验发现，长期食用该地区ST污染的饲料可以诱发实验动物出现食管癌前病变，提示ST的高污染可能是食管癌发生的重要危险因素。因此，有必要深入探讨ST对人食管上皮细胞的损伤作用。
本研究在前期流行病学调查及动物实验的基础之上，利用永生化的人食管上皮细胞(Het-1A)和原代培养的人食管上皮细胞(EPC)作为研究对象，探讨ST对人食管上皮细胞的损伤作用。研究分为三部分，第一部分首先观察ST对Het-1A细胞株DNA的损伤作用以及对DNA修复系统和细胞周期分布的影响，然后进一步探讨错配修复基因的作用。第二部分通过分离培养原代人食管上皮细胞，进一步研究ST对EPC细胞DNA的损伤作用以及对细胞周期的影响，并初步探讨了Het-1A细胞和EPC细胞发生不同周期阻滞的原因。第三部分深入系统地研究了ATM-Chk2和p53-p21信号通路在ST诱导Het-1A细胞和EPC细胞周期阻滞中的作用。本研究结果为揭示ST暴露与人食管上皮损伤乃至食管癌发生的可能关系奠定了基础，对提高我国农村居民，特别是食管癌高发区居民食品安全水平具有重要意义。
第一部分，错配修复基因hMLH1在杂色曲霉素诱导DNA损伤导致Het-1A细胞发生G2期阻滞中的作用
目的:
探讨错配修复基因hMLH1在ST诱导DNA损伤导致Het-1A细胞发生G2期阻滞中的作用。
方法:
1、采用流式细胞定量检测技术(FCM)、吉姆萨(Giemsa)染色和免疫荧光技术分析ST处理后Het-1A细胞周期分布情况。
2、采用蛋白质免疫印迹(WesternBlot)和荧光实时定量PCR(RealtimePCR)方法检测ST处理后G2期关键调节因子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在蛋白水平和mRNA水平上的表达情况。
3、采用免疫共沉淀技术检测Cdc2-CyclinB1复合物的形成情况。
4、采用碱性彗星实验观察ST处理后Het-1A细胞DNA损伤的情况。
5、采用WesternBlot和RealtimePCR方法检测ST处理后DNA修复基因在蛋白水平和mRNA水平上的表达情况。
6、采用FCM和WesternBlot方法检测hMLH1siRNA干扰对细胞周期分布及细胞G2期关键调控因子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的影响。
7、采用碱性彗星实验观察hMLH1siRNA干扰对ST诱导Het-1A细胞DNA损伤的影响。
结果:
1、ST对Het-1A细胞周期分布的影响
FCM结果显示，6、12和24μMST处理组Het-1A细胞G2/M期的细胞比例较溶剂对照组明显增加(P＜0.05)。吉姆萨染色结果显示，与溶剂对照组有丝分裂指数(MI)（8.02±0.59％）相比，12和24μMST处理组细胞MI（5.77±0.23％和5.35±0.28％）明显降低(P＜0.05)。免疫荧光结果显示24μMST处理组细胞表达有丝分裂期标志蛋白p-H3(Ser-10)的细胞数明显少于溶剂对照组。以上结果表明，ST处理可以诱导Het-1A细胞周期发生G2期阻滞。
2、ST对Het-1A细胞G2期关键调节因子的影响
WesternBlot结果显示，ST处理可以上调Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表达水平，同时ST处理还可以升高Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平。免疫共沉淀结果显示，ST处理组Cdc2-CyclinB1复合物的形成明显少于溶剂对照组。Real-timePCR结果显示ST处理可以上调Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在mRNA水平上的表达(P＜0.05)。
3、ST对Het-1A细胞DNA的损伤作用
荧光显微镜下观察，可见溶剂对照组细胞呈圆形，少有“彗星”现象的发生，而24μMST处理组细胞电泳后出现了较多的“彗星”现象，且彗星拖尾明显。经CASP软件进一步统计分析发现，ST处理组Het-1A细胞彗星的TailDNA％、TailLength及OliveTailMoment值均明显高于溶剂对照组(P＜0.05)。结果提示ST可以诱导Het-1A细胞DNA损伤。
4、ST对Het-1A细胞DNA修复系统的影响
Real-timePCR结果表明，ST处理Het-1A细胞24h后，XPC、hMLH1和hMSH2的mRNA表达量均明显高于溶剂对照组(P＜0.05)，而ST处理组细胞内XRCC1、RAD51和DNA-PK的mRNA表达量与溶剂对照组相比均未发生明显变化（P＞0.05）。提示ST诱导的DNA损伤可以启动核苷酸切除修复(NER)和错配修复(MMR)系统。
为了进一步验证ST对MMR系统的影响，我们采用WestemBlot方法观察了ST处理Het-1A细胞后hMLH1和hMSH2蛋白的表达情况。结果显示，ST处理Het-1A细胞24h后，hMLH1和hMSH2蛋白的表达水平明显高于溶剂对照组（P＜0.05）。
5、hMLH1siRNA和hMSH2siRNA干扰效率的检测
hMLH1、hMSH2siRNA以及ControlsiRNA转染48小时后收集细胞。Real-timePCR和Westemblot结果显示:hMLH1和hMSH2siRNA可以显著抑制Het-1A细胞hMLH1和hMSH2mRNA及蛋白的表达。上述结果表明，hMLH1和hMSH2siRNA序列可以明显干扰hMLH1和hMSH2在mRNA和蛋白水平的表达。因此，后续的实验中继续选择hMLH1和hMSH2siRNA序列进行研究。
6、hMLH1siRNA和hMSH2siRNA干扰对ST诱导Het-1A细胞G2期阻滞的影响
FCM结果显示，hMLH1siRNA+DMSO处理组，细胞周期分布与ControlsiRNA+DMSO处理组相比，没有明显变化(P＞0.05)。与ControlsiRNA+24μMST处理组相比，hMLH1siRNA+24μMST处理组G2/M期细胞比例则明显降低(P＜0.05)，但仍高于ControlsiRNA+DMSO处理组(P＜0.05)。表明hMLH1siRNA转染可以部分降低ST诱导的细胞G2/M期比例增高。然而有趣的是，hMSH2siRNA转染对ST诱导的Het-1A细胞G2期阻滞无明显影响（P＞0.05）。提示hMLH1的激活可能部分参与了ST诱导的Het-1A细胞G2期阻滞，而hMSH2的激活并未参与G2期阻滞的发生。
7、hMLH1siRNA干扰对Het-1A细胞G2期调控蛋白的影响
WesternBlot检测结果显示，hMLH1siRNA+DMSO处理组细胞内Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表达水平以及Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平与ControlsiRNA+DMSO处理组相比均没有明显差异(P＞0.05)。与ControlsiRNA+24μMST处理组相比，hMLH1siRNA+24μMST处理组Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表达水平以及Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平明显降低，但仍高于ControlsiRNA+DMSO处理组(P＜0.05)。提示hMLH1siRNA干扰可以部分逆转ST上调G2期调控蛋白的作用。
8、hMLH1在ST诱导DNA损伤导致Het-1A细胞G2期阻滞中的作用模式
采用碱性彗星实验方法观察hMLH1siRNA干扰对ST诱导Het-1A细胞DNA损伤的影响。结果显示，hMLH1siRNA+DMSO和ControlsiRNA+DMSO处理组细胞呈圆形，少有“彗星”现象的发生;而ControlsiRNA+24μMST和hMLH1siRNA+24μMST处理组细胞电泳后均出现了较多的“彗星”现象，两者无明显差异。经CASP软件进一步统计分析发现，与hMLH1siRNA+DMSO和ControlsiRNA+DMSO处理组相比，ControlsiRNA+24μMST和hMLH1siRNA+24μMST处理组Het-1A细胞彗星的TailDNA％、TailLength及OliveTailMoment值均明显增高，但后两者之间相比无明显差异(P＜0.05)。结果表明，ST诱导Het-1A细胞DNA损伤后，hMLH1并未导致二次损伤的发生。提示ST诱导Het-1A细胞DNA损伤后，hMLH1通过DNA损伤应答的普遍模式导致G2期阻滞的发生。
第二部分，SV40大T抗原在杂色曲霉素诱导EPC细胞和Het-1A细胞发生不同周期阻滞中的作用
目的:
探讨SV40大T抗原(SV40LT)在ST诱导EPC细胞和Het-1A细胞发生不同周期阻滞中的作用。
方法:
1、采用碱性彗星实验观察ST处理后EPC细胞DNA损伤的情况。
2、采用FCM技术分析ST处理后EPC细胞周期分布情况。
3、采用WesternBlot方法检测ST处理EPC细胞和Het-1A细胞后G1期关键调控因子的表达情况。
4、采用FCM和WesternBlot方法检测SV40LTsiRNA干扰对细胞周期分布及细胞G1和G2期关键调控因子的影响。
结果:
1、ST对EPC细胞DNA的损伤作用
荧光显微镜下观察，可见溶剂对照组细胞呈圆形，少有“彗星”现象的发生，而24μMST处理组细胞电泳后出现了较多的“彗星”现象，且彗星拖尾明显。经CASP软件进一步统计分析发现，与对照组相比，ST处理组EPC细胞彗星的TailDNA％、TailLength及OliveTailMoment值均明显高于溶剂对照组(P＜0.05)。提示ST可以诱导EPC细胞发生DNA损伤。
2、ST对EPC细胞周期分布的影响
FCM检测结果表明，与溶剂对照组相比，除6μMST处理组外，12μM和24μMST处理组EPC细胞G0/G1期的细胞比例明显增加(P＜0.05)。提示ST处理可显著影响原代培养的EPC细胞细胞周期分布，引起细胞G1期阻滞。
3、ST对EPC细胞G1期关键调控因子的影响
WesternBlot检测结果显示，与溶剂对照组相比，给予不同浓度ST作用24h后，EPC细胞Rb的蛋白表达水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表达水平明显减少，同时ST处理可以下调CyclinD1、Cdk4、CyclinE1和Cdk2蛋白的表达水平(P＜0.05)。
4、ST对Het-1A细胞G1期关键调控因子的影响
WesternBlot检测结果显示，与溶剂对照组相比，给予不同浓度ST作用24h后，Het-1A细胞Rb的蛋白表达水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表达水平明显增加，同时ST处理可以下调Het-1A细胞内CyclinD1和Cdk4蛋白的表达水平，同时上调CyclinE1和Cdk2蛋白的表达水平(P＜0.05)。
5、SV40LTsiRNA干扰效率的检测
SV40LTsiRNA以及ControlsiRNA转染48小时后收集细胞。Real-timePCR和Westernblot结果显示:SV40LTsiRNA可以显著降低Het-1A细胞SV40LTmRNA和蛋白的表达。上述结果表明，SV40LTsiRNA序列可以明显干扰SV40LT在mRNA和蛋白水平的表达。因此，后续的实验中继续选择该siRNA序列进行研究。
6、SV40LTsiRNA干扰对ST诱导Het-1A细胞发生G2期阻滞的影响
FCM结果显示，SV40LTsiRNA+DMSO处理组，细胞周期分布与ControlsiRNA+DMSO处理组相比，没有明显变化(P＞0.05)。与ControlsiRNA+24μMST处理组相比，SV40LTsiRNA+24μMST处理组G0/G1期细胞比例明显升高(P＜0.05)，而G2/M期细胞比例则明显降低(P＜0.05)，但仍高于ControlsiRNA+DMSO处理组(P＜0.05)。
7、SV40LTsiRNA_干扰对Het-1A细胞G1期关键调控因子(Rb/p-Rb和E2F1)的影响
WesternBlot检测结果显示，SV40LTsiRNA+DMSO处理组细胞内Rb的蛋白水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表达水平与ControlsiRNA+DMSO处理组相比均没有明显差异(P＞0.05)。与ControlsiRNA+24μMST处理组相比，SV40LTsiRNA+24μMST处理组Rb的蛋白水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。
8、SV40LTsiRNA干扰对Het-1A细胞G2期关键调控因子(Cdc2/p-Cdc2和CyclinB1)的影响
WesternBlot检测结果显示，SV40LTsiRNA+DMSO处理组细胞内Cdc2的蛋白水平和磷酸化水平以及CyclinB1的蛋白表达水平与ControlsiRNA+DMSO处理组相比均没有明显差异(P＞0.05)。与ControlsiRNA+24μMST处理组相比，SV40LTsiRNA+24μMST处理组Cdc2的蛋白水平和磷酸化水平以及CyclinB1的蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。
综合以上结果表明，敲低Het-1A细胞中的SV40LT抗原会部分逆转ST对Het-1A细胞周期分布及G1期和G2期调控蛋白的影响，并且低表达SV40LT抗原的Het-1A细胞被ST处理后，有发生G1期阻滞的倾向。提示在SV40LT抗原存在的情况下，Het-1A细胞不会发生G1期阻滞。
第三部分，ATM-Chk2和p53-p21信号通路在杂色曲霉素诱导的Het-1A及EPC细胞周期阻滞中的作用
目的:
探讨杂色曲霉素诱导Het-1A细胞G2期阻滞和EPC细胞G1期阻滞的可能分子机制。
方法:
1、采用WesternBlot方法观察ST单独处理后ATM-Chk2和p53-p21信号通路相关分子的表达情况。
2、给予ATM特异性抑制剂KU55933预处理后检测Het-1A细胞中ATM-Chk2信号通路的激活情况以及Het-1A细胞周期的分布情况。
3、采用FCM和WesternBlot方法观察p53siRNA干扰对细胞周期分布及细胞G2期关键调控因子的影响。
结果:
1、ST处理对EPC细胞ATM-Chk2和p53-p21信号通路的影响
WesternBlot结果显示，24μMST处理EPC细胞24h后，ATM和Chk2蛋白的表达水平较溶剂对照组相比无明显差别(P＞0.05)。但是，24μMST处理组ATM和Chk2的磷酸化水平则较溶剂对照组明显升高(P＜0.05)。提示ST可以激活EPC细胞中的ATM-Chk2信号通路。
WesternBlot结果显示，24μMST处理EPC细胞24h后，p53的磷酸化水平以及p53和p21蛋白的表达水平较溶剂对照组相比明显降低(P＜0.05)。提示ST没有激活EPC细胞中的p53-p21信号通路。
以上结果提示:ST处理可以激活EPC细胞中的ATM-Chk2信号通路，而p53-p21信号通路没有被激活。
2、ST对Het-1A细胞ATM-Chk2和p53-p21信号通路的影响
WesternBlot结果显示，24μMST处理Het-1A细胞24h后，ATM和Chk2蛋白的表达水平较溶剂对照组相比无明显差别(P＞0.05)。但是，24μMST处理组ATM和Chk2的磷酸化水平则较溶剂对照组明显升高(P＜0.05)。提示ST可以激活Het-1A细胞中的ATM-Chk2信号通路。
WesternBlot结果显示，24μMST处理Het-1A细胞24h后，p53的磷酸化水平以及p53和p21蛋白的表达水平较溶剂对照组相比明显升高(P＜0.05)。提示ST处理可以激活Het-1A细胞中的p53-p21信号通路。
以上结果提示:ST处理后Het-1A细胞中的ATM-Chk2和p53-p21信号通路被激活。
3、KU55933预处理对Het-1A细胞中ATM-Chk2信号通路的影响
给予ATM特异性抑制剂KU55933预处理后进一步观察ST对ATM-Chk2信号通路的影响。WesternBlot结果显示，KU55933预处理+ST处理组ATM和Chk2的磷酸化水平较ST单独处理组明显下降(P＜0.05)，表明KU55933可以阻断ST诱导的Het-1A细胞ATM-Chk2信号通路的激活。
4、KU55933预处理对ST作用后Het-1A细胞周期的影响
FCM检测结果显示，与ST单独处理组相比，KU55933预处理+ST处理组细胞周期分布无明显改变(P＞0.05)。表明KU55933预处理不影响ST诱导的G2/M期细胞比例增高，提示ATM-Chk2信号通路的激活并不参与ST诱导Het-1A细胞的G2期阻滞。
5、p53siRNA干扰效率的检测
p53siRNA以及ControlsiRNA转染48小时后收集细胞。Real-timePCR和Westernblot结果显示:p53siRNA可以显著降低Het-1A细胞p53mRNA和蛋白的表达。上述结果表明，p53siRNA序列可以明显干扰p53在mRNA和蛋白水平的表达。因此，后续的实验中继续选择该siRNA序列进行研究。
6、p53siRNA干扰对p53-p21信号通路的影响
WesternBlot检测结果显示，与ControlsiRNA+24μMST处理组相比，p53siRNA+24μMST处理组p53的磷酸化水平以及p53和p21的蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。提示p53siRNA干扰可以阻断ST诱导的Het-1A细胞p53-p21信号通路的激活。
7、p53siRNA干扰对ST作用后Het-1A细胞周期的影响
FCM结果显示，与ControlsiRNA+24μMST处理组相比，p53siRNA+24μMST处理组S期细胞比例明显升高(P＜0.05)，而G2/M期细胞比例则明显降低(P＜0.05)。表明p53siRNA转染可以逆转ST诱导的Het-1A细胞G2/M期比例增高。提示p53的激活参与了ST诱导的Het-1A细胞G2期阻滞。
8、p53siRNA干扰对ST作用后Het-1A细胞G2期关键调控因子表达变化的影响
WesternBlot检测结果显示，与ControlsiRNA+24μMST处理组相比，p53siRNA+24μMST处理组Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表达水平以及Cdc25C和Cdc2磷酸化明显降低(P＜0.05)。提示p53siRNA干扰可以逆转ST上调G2期调控蛋白的作用。
综上结果表明，ST处理可以激活Het-1A细胞中ATM-Chk2、p53-p21信号通路，进一步阻断实验表明，ATM-Chk2信号通路的激活并不参与ST诱导的Het-1A细胞周期G2期阻滞，而p53-p21信号通路的激活参与调控ST诱导的Het-1A细胞G2期阻滞。
结论:
1、ST可以诱导DNA损伤，导致Het-1A细胞发生G2期阻滞。
2、hMLH1可能作为DNA损伤的直接感应因子启动信号级联反应，上调G2/M期关键调控因子（CyclinB1、Cdc2/p-Cdc2和Cdc25C/p-Cdc25C），进而参与ST诱导的Het-1A细胞G2期阻滞。
3、ST可以诱导DNA损伤，导致EPC细胞发生G1期阻滞。
4、ST诱导细胞DNA损伤后，EPC细胞发生G1期阻滞很可能是人食管上皮细胞对ST-DNA损伤的一般应答反应，而Het-1A细胞由于SV40LT抗原的存在缺失G1期检测点功能而掩盖了人食管上皮细胞的这一应答反应。
5、ATM-Chk2信号通路的激活，可能参与ST诱导的EPC细胞G1期阻滞，而不参与ST诱导的Het-1A细胞G2期阻滞。
6、p53-p21信号通路的激活可能通过调控G2期关键调控因子，进而参与ST诱导的Het-1A细胞G2期阻滞。
杂色曲霉素;食管上皮细胞;DNA损伤;细胞周期;信号通路
河北医科大学
博士
病理学与病理生理学
张祥宏
2013
中文
R735.1
131
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）