低氧激活非折叠蛋白反应对下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的作用及机制
头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是人体常见的恶性肿瘤，在发展中国家是第三大最常见的肿瘤，在全球排名第六。由于HNSCC发病部位较隐蔽，且多呈浸润性生长，粘膜下易扩散，淋巴结转移率较高，预后较差。迄今为止，针对晚期头颈鳞癌的主要治疗方案是以手术为主，配以放化疗为主的综合治疗。尽管过去的20-30年里在HNSCC的诊断和治疗方面有了一定的改进，但患者的5年存活率却无明显改善。头颈鳞癌对放化疗敏感性较低，难以控制的局部复发和转移是导致其预后较差的主要原因。因此，重估当前对HNSCC的认识，深入研究肿瘤发生、发展的机理及寻求新的有效治疗策略是至关重要的。
目前大量研究表明，肿瘤细胞对放化疗的治疗抵抗与其生长的微环境密不可分。肿瘤细胞较正常细胞生长速度快，耗氧量增加，并且肿瘤内部血管分布杂乱无章，血供相对不足，造成实体肿瘤内部微环境低氧。低氧可造成肿瘤细胞生长周期阻滞、药物弥散障碍、基因转录活性及其表达产物发生变化，促进肿瘤细胞的生存、侵袭及转移，造成对放化疗的抗性增强。研究表明，低氧是头颈鳞癌不良预后的最关键因素。因此靶向肿瘤微环境低氧，将对头颈鳞癌的治疗起到巨大的推动作用。
在实体肿瘤组织中，氧含量的变化波动于常氧甚至几乎完全缺氧，并且不同程度低氧引起细胞低氧耐受的机制不同。最新的研究进展表明，非折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)依赖途径是肿瘤适应低氧的重要途径，并且在肿瘤组织中存在特异性激活。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）是UPR发生的标志性因子和中心调控因子，对多种实体肿瘤的发生和发展起到了重要作用，但在头颈鳞癌中低氧是否引起UPR的特异性激活，以及其激活对头颈鳞癌化疗敏感性的作用至今还不清楚。
本研究将从检测下咽癌组织中UPR相关蛋白GRP78和CHOP的表达情况入手，进一步检测低氧情况下，UPR通路相关蛋白的表达及其与化疗敏感性的关系，从靶向肿瘤适应低氧的UPR途径找到克服头颈鳞癌低氧治疗抵抗的有效方法，为减少下咽癌的复发和改善预后提供理论基础和方法学依据。实验分为三部分:
第一部分 UPR相关蛋白GRP78及CHOP在下咽癌中的表达及其与临床病理因素的关系
目的:检测UPR相关蛋白GRP78及CHOP在下咽癌组织中的表达，并与临床病理因素进行相关分析，探讨其在下咽癌发生、发展中的作用。
方法:
1、免疫组织化学方法检测47例下咽癌组织及12例癌旁正常下咽粘膜组织中GRP78及CHOP的表达，并与临床诸病理因素进行相关分析。
2、Western blot技术检测4例下咽癌患者癌组织和癌旁正常下咽组织中GRP78及CHOP的表达。
结果:
1、免疫组化结果
1.1、GRP78和CHOP在下咽癌组织及癌旁组织中的表达:47例下咽癌中有41例GRP78表达阳性（阳性率87.23％），26例CHOP表达阳性（阳性率55.32％）。12例癌旁正常下咽组织中GRP78表达阳性率为33.33％，CHOP表达阳性率为0％。与癌旁正常下咽粘膜比较，下咽肿瘤组织中GRP78与CHOP的阳性表达率均明显升高(x2=12.512，P=0.000;x2=11.868，P=0.001)。
1.2、GRP78及CHOP与下咽癌临床病理因素的关系:GRP78在中低分化的下咽癌组织中表达阳性率为94.87％，明显高于高分化组织，其阳性表达率为50.00％（=8.311，P=0.004）;CHOP在中低分化的表达阳性率是58.97％，在高分化组织中阳性表达率37.5％，但差异无统计学意义（x2=0.522，P=0.470）。GRP78在T3-T4期阳性表达率为96.55％，明显高于T1-T2期72.22％的阳性表达率(x2=3.921，P=0.048);CHOP在T3-T4与T1-T2期阳性表达率分别为51.72％与55.56％，二者之间差异无统计学意义（x2=0.065，P=0.798）。GRP78在Ⅲ-Ⅳ期的阳性表达率为97.14％，明显高于Ⅰ-Ⅱ期，其阳性表达率为58.33％(x2=8.852，P=0.003);CHOP在Ⅲ-Ⅳ期、Ⅰ-Ⅱ期的阳性表达率分别为57.14％和50％，差异无统计学意义（x2=0.184，P=0.668）。在淋巴结转移病例中GRP78的表达率明显增高，阳性率为100％(x2=7.499，P=0.006);CHOP表达阳性率为53.57％(x2=0.086，P=0.770);GRP78在下咽癌组织中的表达与肿瘤的病理分化程度、肿瘤T分期、临床分期和淋巴结转移密切相关，与患者的年龄、性别及肿瘤生长部位无明显相关性(P＞0.05)。CHOP的表达与病理分化程度、肿瘤T分期、临床分期、淋巴结转移及其它临床病理因素均无明显关性(P＞0.05)。
2、Western blot检测4例下咽癌患者癌组织中GRP78及CHOP的表达均较癌旁正常下咽组织的表达明显升高。
结论:UPR相关蛋白GRP78及CHOP在下咽癌组织中的表达较癌旁正常组织均明显升高，提示下咽癌组织中存在UPR的激活。
第二部分慢病毒介导的稳定干扰GRP78下咽癌FaDu细胞系的建立
目的:构建慢病毒介导的稳定干扰GRP78基因的下咽癌FaDu细胞系，为后续研究GRP78在下咽癌发生、发展中的作用提供细胞模型。
方法:
1、针对GRP78基因序列由GeneCopoeia公司设计合成4条shRNA并构建RNAi慢病毒载体，均经DNA测序验证，同时以未转染（blank）及转染乱码序列载体(scshRNA)做阴性对照。采用脂质体法将慢病毒表达载体转染293T细胞，应用实时荧光定量PCR及Western blot筛选出具有显著敲减作用的LV-GRP78-shRNA。
2、将对GRP78基因敲减作用最明显的慢病毒载体LV-GRP78-shRNA2与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，产生慢病毒颗粒，将纯化的慢病毒颗粒感染人下咽癌FaDu细胞，嘌呤霉素筛选稳定沉默GRP78的下咽癌FaDu细胞。
3、流式细胞仪检测稳定干涉GRP78的细胞株的荧光表达效率。
4、实时荧光定量PCR和Western blot检测转染前后FaDu细胞中GRP78的mRNA及蛋白的表达。
结果:
1、慢病毒载体LV-GRP78-shRNA2，LV-GRP78-shRNA3，LV-GRP78-shRNA4感染293T细胞后，GRP78mRNA及蛋白的表达量均明显减少，其中以LV-GRP78-shRNA2作用最为显著。
2、用最优筛选浓度为2.5μg/ml的嘌呤霉素筛选出稳定干扰GRP78的FaDu细胞克隆。
3、应用流式细胞仪检测荧光表达效率，未转染组、乱序干涉载体组及稳定敲低GRP78组的FaDu细胞，分别为0.833±0.115％，99.93±0.058％及99.97±0.058％。
4、经实时荧光定量PCR检测稳定转染下咽癌FaDu细胞LV-GRP78-shRNA2组分别与乱序对照组（scshRNA）及空白对照组(blank)比较GRP78mRNA水平均有明显下降，差异有统计学意义（t=24.900，P=0.000;t=-28.604，P=0.000）。乱序对照组与空白对照组比较GRP78mRNA水平无明显变化（t=1.943，P=0.124）。
5、Western blot法检测稳定转染下咽癌FaDu细胞LV-GRP78-shRNA2组分别与乱序对照组（scshRNA）及空白对照组(blank)比较GRP78蛋白水平均有明显下降，差异有统计学意义（t=-11.388，P=0.000; t=-13.004，P=0.000）。乱序对照组与空白对照组比较GRP78蛋白水平无明显变化(t=0.066; P=0.951)。
结论:利用慢病毒载体成功构建稳定干扰GRP78基因的下咽癌FaDu细胞系，为后续研究该基因的功能提供细胞模型。
第三部分重度低氧激活UPR与GRP78-shRNA对下咽癌FaDu细胞的化疗敏感性的影响及作用机制
目的:观察不同程度低氧对UPR的激活作用及对下咽癌FaDu细胞增殖的影响，进一步研究低氧诱导GRP78的表达在下咽癌化疗抵抗中的作用，并探讨其作用机制。
方法:本研究于常氧及不同程度低氧培养F aDu细胞，检测UPR相关蛋白的表达变化，同时检测不同浓度顺铂对FaDu细胞的增殖抑制作用及其对细胞凋亡的影响，并检测敲减GRP78联合顺铂治疗对细胞增殖及凋亡的影响。
1、免疫细胞化学方法检测UPR相关蛋白GRP78和CHOP在常氧(20％ O2)、中度(1％O2)及重度低氧(＜0.02％O2)低氧培养条件下的表达。
2、Western blot方法检测下咽鳞癌FaDu细胞GRP78与CHOP在常氧及不同程度低氧培养条件下3，6，9，12及24h表达的动态变化。
3、MTT法检测顺铂在常氧、中度及重度低氧培养条件下对下咽癌FaDu细胞增殖的抑制作用，并观察敲减GRP78联合顺铂在常氧及重度低氧培养条件下对FaDu细胞增殖的影响。
4、流式细胞术PI法检测在常氧、重度低氧培养条件下敲减GRP78联合顺铂治疗对FaDu细胞凋亡的影响。
5、分别对FaDu细胞GRP78未敲减（GRP78（+/+））和GRP78敲减(GRP78(-/-)）细胞系进行常氧和重度低氧培养，免疫细胞化学方法检测培养24小时GRP78和CHOP的表达变化。
6、Western blot检测在常、低氧培养条件下敲减GRP78对凋亡相关蛋白CHOP、Bcl-2及Bax的表达调控。
结果:
1、免疫细胞化学方法检测UPR相关蛋白GRP78和CHOP在不同程度低氧培养条件下的表达:下咽鳞癌FaDu细胞在中度低氧培养24h较常氧培养组比较GRP78与CHOP的表达均无明显变化（t=0.459，P=0.67; t=0.226，P=0.832），而重度低氧培养24h较常氧组比较，GRP78的表达明显升高，有非常显著性差异（t=14.709，P=0.000）;CHOP的表达明显升高，差异有统计学意义（t=4.432，P=0.011）。GRP78与CHOP在重度低氧组的表达较中度低氧组比较均明显升高，有统计学差异（t=13.055，P=0.000;t=3.85，P=0.018）。
2、Western blot检测GRP78与CHOP在常氧及不同程度低氧培养条件下的表达变化，结果显示:FaDu细胞在中度低氧培养3，6，9，12及24h时GRP78与CHOP的表达较常氧培养组均无明显变化(P＞0.05);低氧标志性蛋白HIF-1α于低氧6h至24h逐渐升高，24h达峰值。GRP78在重度低氧培养3h至9h逐渐升高，9h至24h维持在较高水平，与常氧培养组比较有显著性差异（3h，6h，P＜0.05;9h，12h，24h，P＜0.01）。CHOP在重度低氧培养12h开始升高，24小时达到高峰，与常氧培养组比较有显著性差异（12h，P＜0.05;24h，P＜0.01）。与常氧组比较，HIF-1α在重度低氧培养条件下3h已明显升高，6h至12h维持在较高水平，24h有明显下降，但仍高于常氧水平。差异有统计学意义(3h，6h，9h，P＜0.01;12h，24h, P＜0.05)。
3、MTT检测结果
3.1、不同程度低氧培养条件下顺铂对FaDu细胞增殖的影响:中、重度低氧较常氧比较均可导致顺铂对FaDu细胞的增殖抑制作用降低(F=25.692，P=0.013，P＜0.05;F=181.063，P=0.000，P＜0.01)，以重度低氧组较为显著。重度低氧培养条件下，顺铂对FaDu细胞的增殖抑制作用较中度低氧亦明显降低，差异有统计学意义(F=80.537，P=0.000; P＜0.01)。
3.2、敲减GRP78联合顺铂在常氧及重度低氧培养条件下对FaDu细胞增殖的影响:重度低氧培养条件下，顺铂对GRP78(+/+)与GRP78(-/-)细胞的增殖抑制作用较常氧比较均明显降低(F=84.153，P=0.000，P＜0.01;F=211.988，P=0.000，P＜0.01)，GRP78(-/-)细胞分别于常氧、低氧培养条件下，较GRP78(+/+)组比较，顺铂对细胞的增殖抑制作用均明显升高（F=75.301，P=0.000,P＜0.01;F=138.500,P=0.000,P＜0.01）。
4、流式细胞术PI法检测细胞凋亡
低氧培养条件下，FaDu细胞的凋亡率较常氧组比较明显减低，有统计学差异（t=-4.525，P=0.011，P＜0.05），GRP78(-/-)组较GRP78(+/+)组比较，常氧培养24h凋亡率无明显变化（t=2.158，P=0.097，P＞0.05），而低氧培养条件下的凋亡率明显提高，差异有统计学意义（t=4.213，P=0.016，P＜0.05）。常氧及重度低氧培养条件下，GRP78（-/-）化疗组较GRP78(+/+)化疗组比较凋亡率均明显升高，且以低氧培养条件下升高更为显著（t=8.827，P=0.011,P＜0.05; t=12.803,P=0.000,P＜0.01）。
5、免疫细胞化学检测敲减GRP78对CHOP的影响
FaDu细胞在常氧、重度低氧培养24h时GRP78(-/-)组较GRP78(+/+)组比较GRP78的表达均有明显下降（t=-3.769，P=0.023，P＜0.05; t=-6.742，P=0.003，P＜0.01）;GRP78（-/-）组较GRP78(+/+)组比较，常氧培养24h时CHOP的表达无明显变化（t=0.331，P=0.767，P＞0.05），而低氧组CHOP的表达明显升高，差异有统计学意义（t=5.616，P=0.005，P＜0.01）。
6、Western blot检测GRP78对凋亡相关蛋白表达的影响
GRP78在常氧、重度低氧培养条件下GRP78(-/-)组较GRP78(+/+)组比较表达均明显降低（t=-10.052，P=0.006，P＜0.01;t=-12.209，P=0.006，P＜0.01）;CHOP在重度低氧培养条件下较常氧组比较表达明显升高（t=3.418，P=0.025，P＜0.05）。GRP78(-/-)组较GRP78(+/+)组比较，常氧培养24h时CHOP的表达无明显变化(t=0.08，P=0.94，P＞0.05)，而在低氧组CHOP的表达明显升高，差异有统计学意义（t=4.24，P=0.013，P＜0.05）。Bcl-2和Bax在常氧培养条件下GRP78(-/-)组较GRP78(+/+)组比较表达均无明显变化(P＞0.05)。低氧培养24h时，Bcl-2较常氧组比较表达明显升高（t=5.569，P=0.005，P＜0.01），Bax的表达明显降低（t=-3.081，P=0.037，P＜0.05）。低氧培养24h时，GRP78(-/-)组较GRP78(+/+)组比较Bcl-2明显降低（t=-13.25，P=0.000，P＜0.01），Bax的表达明显升高，有统计学差异（t=17.127，P=0.000，P＜0.01）。
结论:
1、重度低氧在人下咽鳞癌FaDu细胞中可激活UPR，导致GRP78和CHOP的表达升高，而中度低氧在观测时间范围内不能激活UPR。
2、低氧可造成下咽癌FaDu细胞的化疗抵抗，并且低氧程度越重，化疗抵抗越明显。
3、重度低氧诱导GRP78表达升高，与下咽癌FaDu细胞的增殖及化疗耐受密切相关。敲减GRP78可明显抑制下咽癌FaDu细胞的增殖，诱导细胞凋亡，增强细胞对顺铂治疗的敏感性。
4、敲减GRP78可明显抑制Bcl-2的表达，诱导CHOP及Bax的表达升高，从而提高FaDu细胞在低氧微环境下的化疗敏感性。
5、下咽癌FaDu细胞主要通过UPR依赖途径适应重度低氧，下调UPR中心调控因子GRP78有望成为克服HNSCC低氧耐受及治疗抵抗的有效策略。
低氧激活非折叠蛋白反应;下咽癌;FaDu细胞;敏感性;化学疗法;临床疗效;病理特征
河北医科大学
博士
外科学
李晓明
2013
中文
R739.63
113
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）