大白菜BrTCP24基因克隆及功能分析
TCP家族转录因子是植物所特有的，它含有一种特有的bHLH保守结构域。植物的叶片弯曲以及大小都可能受到TCP基因家族的影响。本试验从大白菜自交系福山包头中分离了拟南芥(Arabidopsisthaliana)TCP的同源基因，命名为BrTCP24，并构建了BrTCP24基因的植物表达载体。将该基因转入拟南芥，获得了相应的纯合转基因植株，对转基因植株与野生型的表型性状进行观察比较，并且在生物信息学方面对BrTCP24基因做了相关分析。主要结果如下:
1.BrTCP24基因的克隆
扩增出一条分子质量约为1200bp的条带，经测序，该片段为1221bp，与预期的目的片段大小一致。经PCR、酶切及测序验证，证明BrTCP24基因片段已经连接到植物表达载体pCAMBIA2300上。
2.PCR鉴定转基因拟南芥
采用根癌农杆菌介导的浸花法侵染拟南芥，获得了转基因植株。提取转基因拟南芥总RNA，并成功扩增到外源BrTCP24基因。
3.氨基酸序列分析
对BrTCP24基因所编码的蛋白质氨基酸序列进行比对分析，结果表明大白菜BrTCP24蛋白质与拟南芥AtTCP4蛋白质的氨基酸序列的一致性为77.57％，核酸的一致性为77.15％。
4.BrTCP24基因过量表达可能抑制了与器官大小有关的基因表达
通过半定量RT-PCR检测了跟器官体积大小有关的基因AtEXP10，还有与细胞分裂有关的基因AtCYCD3;1，AtG1F1和AtGRF5。与对照拟南芥相比，转基因拟南芥中AtEXP10，AtCYCD31,AtGIF1和AtGRF5基因的表达水平减弱。这些结果表明在拟南芥的发育过程中，BrTCP24基因的过量表达可能抑制了与器官大小有关的基因的表达从而使拟南芥器官变小。
5.转基因植株的性状观察
在含Kn的1/2MS培养基上，筛选植株暗处理7天，同时筛选5株长势好的植株，将其移入新的培养基和培养瓶中继续培养两周，观察并记录数据，发现转基因植株的下胚轴明显短于野生型，而且长势弱，开花比野生型晚。为了进一步确定转基因植株，将在1/2MS培养基上生长16天的植株移植到培养土中继续培养24天，可发现转基因植株（35S::BrTCP24）叶片明显比野生型叶片小。推测可能与转入的外源BrTCP24基因有关。
拟南芥;大白菜;BrTCP24基因;克隆技术;转基因植物
青岛农业大学
硕士
蔬菜学
程斐
2012
中文
S634.1;S601
50
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）