半乳糖受体介导的肝靶向纳米粒给药系统的实验研究
冬凌草甲素(oridonin，ORI)是从唇形科香茶菜属植物冬凌草(Rabdosia rubescens)中分离得到的二萜类化合物，它在治疗肝癌和白血病等方面的作用受到越来越多的关注。近年来，研究证明冬凌草甲素有明显的抗肿瘤作用，包括抑制肿瘤增长、减轻肿瘤负荷、减少肿瘤并发症等，这些作用能够大大增加肿瘤患者的存活率。然而，冬凌草甲素的溶解性较差，生物半衰期较短，限制了它的临床应用，因此需要研究新的制剂技术来克服这些问题。
本课题利用壳聚糖结构中的氨基和半乳糖酸结构中的羧基偶联，合成了半乳糖基化壳聚糖(galactosylated chitosan，GC)。采用FTIR、1HNMR和XRD的方法对GC的结构进行表征，结果表明半乳糖通过酰胺键偶联于壳聚糖，其中半乳糖的取代度用1HNMR法测定。再采用现代靶向制剂技术，以ORI为模型药物，以具有良好生物相容性和生物可降解性的半乳糖基化壳聚糖、卵磷脂和中链甘油三酸酯(MCT)为载体材料，制备了半乳糖修饰的冬凌草甲素壳聚糖纳米粒(Oridonin-loaded nanoparticles coated with galactosylated chitosan,ORI-GC-NP)给药系统，并对纳米粒的构建及其性质等内容进行了研究。实验以包封率为主要考察指标，通过单因素分析对处方工艺进行优化，考察了脂质材料、表面活性剂及有机溶剂的种类和用量、注入方式、旋蒸工艺等，确定最佳处方和工艺，然后考察了纳米粒的包封率和载药量、形态、粒径、Zeta电位、体外释药特点以及细胞毒性。最后以冬凌草甲素溶液为对照品，考察了冬凌草甲素纳米粒经尾静脉注射后在小鼠体内主要器官的分布情况和在大鼠体内的药物动力学特征，以期提高抗肿瘤药物冬凌草甲素的疗效，通过控制药物在靶标区域的释放，实现药物的优化给药。
通过单因素分析优化的最佳处方工艺为:选用对冬凌草甲素溶解性较好的MCT作为液态脂质材料，选用带负电的卵磷脂作为表面活性剂，卵磷脂/MCT质量比为2∶1，药物与卵磷脂/MCT总质量比为1∶30，GC在水相中的浓度为0.25mg·mL-1。将处方量的冬凌草甲素、MCT、卵磷脂均匀地分散在2.5mL体积比为7∶3的乙醇/丙酮混合溶剂中，得到有机相;将处方量GC分散在10mL双蒸水中，得到水相。将制得的有机相在室温下和搅拌速度为800～1000r·min-1的条件下，加入到上述水相中，反应适当时间后得到初乳，然后在45℃、真空条件下旋转蒸发除去有机溶剂。由此所得纳米粒溶液即为ORI-GC-NP。ORI-NP的制备方法同上，只是在水相中不加GC聚合物，以此作为对照。优化工艺操作简单，所制备的纳米粒包封率稳定，ORI-NP和ORI-GC-NP的平均包封率分别为85.43％、72.15％，载药量分别为4.35％、2.69％。透射电镜下观察所得纳米粒均为类球形结构，表面光滑，粒径分布较均匀，平均粒径分别为200.7nm、282.2nm，Zeta电位分别为-32.59mV、-12.88mV。以透析法考察ORI-GC-NP中冬凌草甲素的体外释放特性，在pH7.4的释放介质中，药物12h的累积释放率为69％;而在pH6.0的释放介质中，12h药物的累积释放率大于80％。由此可见，纳米粒中药物的释放具有一定的pH敏感性，在弱酸性释放介质中，药物的释放速率增加。
采用MTT法分别考察冬凌草甲素（ORI）、空白半乳糖修饰的壳聚糖纳米粒(GC-NP)、冬凌草甲素纳米粒(ORI-NP)及半乳糖修饰的冬凌草甲素壳聚糖纳米粒（ORI-GC-NP），在不同浓度和不同时间，对人肝癌HepG2细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒作用。结果表明空白纳米粒GC-NP对这两种肿瘤细胞均无明显的毒性;ORI-GC-NP、ORI-NP和ORI对细胞的抑制作用具有一定的时间和浓度依赖性，随着浓度的增大和时间的延长，毒性作用有所增大，且ORI-GC-NP对这两种细胞的抗肿瘤作用均高于ORI-NP和ORI;ORI-GC-NP对HepG2的作用大于MCF-7。
本文采用高效液相色谱法(HPLC)分别测定了小鼠尾静脉注射ORI-GC-NP、ORI-NP和ORIsolution后体内各主要组织器官中ORI的经时变化规律和分布情况。结果表明，与ORIsolution组比较，ORI-NP在小鼠体内的相对摄取率依次（从高到低）为肝(4.784)、脾(4.110)、血(1.463)、心(0.719)、肺(0.495)、肾(0.277);ORI-GC-NP在小鼠体内的相对摄取率依次（从高到低）为肝(8.165)、脾(3.754)、血(2.320)、肺(0.700)、心(0.568)、肾(0.335)。ORI-NP和ORI-GC-NP都显示出明显的肝靶向性，而ORI-GC-NG的靶向效果更加。由结果可知，ORI制备成纳米粒可以明显延长药物在体内滞留时间，显著增加AUC，明显降低清除率。
大鼠体内的药物动力学研究表明ORI-GC-NP、ORI-NP与ORIsolution的血药浓度-时间曲线都有显著不同。静脉注射ORIsolution后，清除率CLz=0.444L·h-1·Kg-1，平均滞留时间MRT很短为2.531h，AUC为18.038h·μg·mL-1。静脉注射ORI-NP后，与ORIsolution相比，ORI-NP的平均滞留时间MRT有所延长，而清除率则显著下降，分别为MRT=10.683h，CLz=0.195L·h-1·Kg-1，ORI-NP的AUC为40.962h·μg·mL-1。静脉注射ORI-GC-NP后，清除率CLz=0.152L·h-1·Kg-1，MRT=10.715h，AUC=52.717h·μg·mL-1，可知与ORI-NP相比，平均滞留时间MRT有所延长，而清除率也有所下降。
以冬凌草甲素为模型药物制备半乳糖修饰的壳聚糖纳米粒的研究目前国内外尚未见报道，本文的研究成果丰富了肝靶向给药系统的研究内容，而且将为探讨和总结冬凌草甲素肝靶向给药系统提供有较高学术价值的参考和借鉴，为肝癌治疗探索一种新的思路和治疗手段。
肝靶向纳米粒给药系统;半乳糖受体;冬凌草甲素;细胞毒性;组织分布;药物动力学;血药浓度
山东大学
硕士
药剂学
张典瑞
2013
中文
R285
101
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）