紫杉醇-Pluronic P123复合型胶束给药系统的研究
紫杉醇(paclitaxel，PTX)是首选的抗肿瘤药物之一[1]。紫杉醇是从红豆杉属植物的树皮中分离提取的一种四环二萜类化合物，作用机制为与细胞的微管结合，促进微管聚合，抑制微管解聚，从而在细胞内形成稳定的微管束，进而抑制细胞分裂和增殖，使肿瘤细胞停止在G2期和M期，达到抑制肿瘤细胞生长的目的[2]。紫杉醇抗肿瘤谱广、治疗指数高，近年来被广泛用于卵巢癌[3]、乳腺癌[4]、头颈部肿瘤[5]、前列腺癌以及非小细胞肺癌[6]等的治疗。PTX在水中的溶解度极小，口服生物利用度差。目前上市的紫杉醇制剂有两种:紫杉醇注射液（泰素(R)）和紫杉醇白蛋白纳米粒(Abraxane(R))注射剂。前者含有机溶剂，会引起中性粒细胞减少，骨髓抑制及室性心律不齐等副作用，且无药物靶向性;后者采用人血白蛋白制备，其来源受到一定限制，且价格非常昂贵。这些都限制了紫杉醇的临床应用。
聚合物胶束是靶向领域中的一种新型药物载体，近年来受到了广泛的关注，并成为紫杉醇药物递送领域最重要的发展方向之一。两亲性共聚物在水介质中可自发形成具有“核壳”结构的聚合物胶束，疏水嵌段形成胶束的内核，充当疏水药物的储存区，显著提高药物的溶解性和稳定性[7];亲水嵌段在水性环境中伸展并围绕在疏水内核的周围形成亲水性外壳，能有效减少血浆蛋白对胶束的吸附，避免网状内皮细胞的识别和吞噬，使胶束在血液中保持稳定，延长循环时间，并利用EPR效应介导被动靶向。药物分子可通过物理包封和化学结合等手段包裹于聚合物胶束的内核。
本课题旨在研发新的给药系统提高紫杉醇的水溶性，避免有机溶剂的使用，同时选择合适的肿瘤靶向因子将紫杉醇选择性的运送到肿瘤细胞或组织，减少药物在正常组织或器官的分布，降低其不良反应。Pluronic系列共聚物是一种多功能药用辅料嵌段，具有无毒、无免疫原性、生物相容性等优点，还能抑制P-糖蛋白对药物外排作用，逆转肿瘤细胞的多药耐药性，提高药物的活性。其中，PluronicP123(PEO20-b-PPO69-b-PEO20)的疏水嵌段较长，组装形成的疏水内核容量较大，期待其能提高药物载药量。将紫杉醇通过化学结合连接到PluronicP123上得到P123-PTX结合物，在此基础上，通过物理包封的方法将游离药物包裹于P123-PTX聚合物胶束的疏水内核。载药聚合物胶束进入肿瘤组织中能够首先迅速释放物理包封的药物，达到有效的治疗浓度，之后化学键连接的药物再缓慢释放，维持有效的治疗浓度，达到更好的治疗效果。之后采用叶酸作为靶向因子，对亲水外壳进行靶向修饰，获得主动靶向的聚合物胶束。考察了其体外理化性质，评价了其体内外抗肿瘤效果，为紫杉醇靶向胶束制剂的开发提供了实验基础和理论依据。本课题主要分三部分研究了紫杉醇的PluronicP123胶束制剂，研究内容与结果如下:
一、紫杉醇PluronicP123胶束制剂含量测定方法的建立
采用紫外分光光光度法测定紫杉醇PluronicP123胶束制剂中化学连接的紫杉醇含量，高效液相色谱法测定胶束制剂中物理包封的紫杉醇的含量，并对方法学进行了研究。方法学考察结果符合要求，回收率高，重现性好。
二、被动靶向载紫杉醇的PluronicP123胶束制剂的研究
用丁二酸酐将紫杉醇的2'位羟基转化为羧基，进而与PluronicP123上的羟基形成酯键得到P123-PTX结合物。用质子核磁共振光谱(1H-NMR)验证了P123-PTX结合物的结构。由于其仍具有两亲性，P123-PTX结合物在水介质中可自组装形成P123-PTX胶束，或作为聚合物载体材料，进一步物理包封紫杉醇制备P123-PTX/PTX胶束。P123-PTX胶束与P123-PTX/PTX胶束均通过透析法制备而成;单因素考察了P123-PTX/PTX胶束的制备工艺和处方;研究了P123-PTX胶束和P123-PTX/PTX胶束载药量、包封率、外观形态、粒径分布和Zeta电位等理化性质;分别在pH值为5.0和7.4的PBS中研究了P123-PTX胶束和P123-PTX/PTX胶束的体外释药行为。
与紫杉醇原料比较，羧基化紫杉醇的1H-NMR谱中清楚地观察到额外出现δ2.5-2.7处的多重峰，其代表丁二酸酐OCOCH2CH2COOH上质子的化学位移峰，证明羧基化紫杉醇的成功合成。与PluronicP123原料比较，P123-PTX结合物1H-NMR谱中出现一系列新的吸收峰，正好与紫杉醇的1H-NMR谱相对应，可知紫杉醇成功连接到PluronicP123上;紫外可见分光光度法测得P123-PTX胶束中化学连接的紫杉醇含量为(14.00±0.36)％，高效液相色谱法测得P123-PTX/PTX胶束中物理包封的紫杉醇含量为（4.67±0.13）％，因此P123-PTX/PTX胶束的总载药量为(18.69±0.52)％;TEM观察P123-PTX/PTX胶束呈现球形或类球形，形态规整，大小均匀;DLS测得P123-PTX胶束和P123-PTX/PTX胶束的平均粒径分别为(60.12±5.26)nm和(102.63±7.36)nm;Zeta电位分别是(-6.66±0.88)mV和(-11.13±0.62)mV。体外释放结果表明，物理包封PTX制备的P123-PTX/PTX胶束的药物释放明显比P123-PTX快;此外，可能由于酯键的pH敏感性，P123-PTX胶束与P123-PTX/PTX胶束的在不同pH的释放介质中的体外释药行为都表现出pH敏感。在pH7.4的释放介质中，药物释放缓慢，而在pH5.0条件下，药物释放加速。
三、主动靶向载紫杉醇的PluronicP123胶束制剂的研究
利用叶酸上的羧基与P123-PTX上剩余的羟基通过反应制得FA-P123-PTX结合物，用质子核磁共振光谱(1H-NMR)验证了FA-P123-PTX结合物的结构，并用紫外分光光度法测定了叶酸的修饰率。P123-PTX与FA-P123-PTX通过与FITC反应得到了带荧光标记的P123-PTX-FITC与FA-P123-PTX-FITC结合物。通过透析法将FA-P123-PTX结合物作为载体材料物理包封PTX制备了主动靶向FA-P123-PTX/PTX胶束制剂。单因素考察了FA-P123-PTX/PTX胶束的制备工艺和处方;同时通过透析法制备FA-P123-PTX胶束作为对照，荧光标记的P123-PTX-FITC与FA-P123-PTX-FITC结合物胶束用于细胞摄取实验。研究了FA-P123-PTX/PTX胶束载药量、包封率、外观形态、粒径分布和Zeta电位等理化性质;分别在pH值为5.0和7.4的PBS中研究了FA-P123-PTX胶束和FA-P123-PTX/PTX胶束的体外释药行为;考察了人肺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MCF-7和小鼠黑色素癌细胞系B16细胞对荧光标记的P123-PTX-FITC与FA-P123-PTX-FITC结合物胶束的摄取;采用MTT法和AnnexinV-FITC/PI双染法研究了紫杉醇胶束制剂对A549、MCF-7和B16细胞的体外抗肿瘤活性;采用接种鼠源B16黑色素瘤的昆明小鼠，考察了紫杉醇胶束制剂的体内抗肿瘤活性;采用健康昆明小鼠，考察了紫杉醇胶束制剂的最大耐受剂量。
由于FA-P123-PTX是在P123-PTX基础上进行修饰，所以FA-P123-PTX/PTX胶束中化学连接的紫杉醇含量与P123-PTX胶束中紫杉醇含量一致，仍为(14.00±0.36)％。而通过HPLC法测得的FA-P123-PTX/PTX胶束中物理包封的紫杉醇为(4.07±0.12)％，因此FA-P123-PTX/PTX胶束的总载药量为(18.08±0.64)％;DLS测得其平均粒径为(147.57±2.82)nm;Zeta电位为(-9.31±1.07)mV。体外释放实验表明，FA-P123-PTX胶束与FA-P123-PTX/PTX胶束仍表现出pH敏感性。细胞摄取试验表明，细胞对荧光标记的两种胶束制剂的摄取率均随时间的延长而增强。在叶酸受体阳性细胞MCF-7和B16细胞中，FA-P123-PTX-FITC胶束在细胞中的蓄积程度要显著高于非靶向组P123-PTX-FITC胶束，而在叶酸受体阴性细胞A549中，两者的摄取率无显著性差异，这说明叶酸介导的胶束载体具有显著的靶向性。体外细胞实验结果显示，与泰素(R)相比，P123-PTX胶束对A549、MCF-7和B16细胞的IC50值均高于泰素(R)组的IC50值，这可能由于酯键断裂需要时间，释放药物的速度较慢，难以在短时间内达到有效的药物浓度。但P123-PTX/PTX胶束的IC50值明显低于P123-PTX胶束，这表明通过化学结合与物理包封联合制备的胶束制剂的药效要优于单独使用化学结合的胶束制剂，可明显抑制肿瘤细胞生长。在叶酸受体阳性细胞MCF-7和B16细胞中，主动靶向FA-P123-PTX/PTX胶束的IC50值明显低于泰素(R)和被动靶向P123-PTX/PTX胶束组，而在叶酸受体阴性细胞A549中，主动靶向胶束与被动靶向胶束的IC50值无明显差异。细胞凋亡实验结果与MTT法结果一致。因此，体外细胞实验中，与被动靶向胶束相比，主动靶向胶束对叶酸受体阳性细胞显示出较强的抗肿瘤活性。
体内药效学实验结果表明，P123-PTX胶束与泰素(R)的抑瘤效果无差异(P＞0.05)，P123-PTX/PTX胶束组较泰素(R)和P123-PTX胶束组又有更好的治疗效果(P＜0.05)。FA-P123-PTX/PTX组与P123-PTX/PTX组比较，小鼠瘤体积又有所减小(P＜0.05)，表明通过化学结合和物理包封制备的P123-PTX/PTX胶束要比仅化学结合的P123-PTX胶束和泰素(R)疗效好，主动靶向制剂要比被动靶向制剂疗效好。同时小鼠体重变化也有差异，其中泰素(R)组小鼠体重增加最少(P＜0.01)。由于体重变化是判断制剂毒性的一个重要指标，且小鼠对P123-PTX/PTX胶束与FA-P123-PTX/PTX胶束的最大耐受剂量为150mg/kg和200mg/kg，远远高于泰素(R)的50mg/kg。因此上述结果说明各紫杉醇PluronicP123胶束制剂的毒性作用均小于市售注射液泰素(R)，具有临床用药的价值。
综上所述，本研究制备的紫杉醇PluronicP123胶束制剂是一种紫杉醇新剂型，能够显著提高紫杉醇的溶解性和载药量，增加对肿瘤的靶向性，增强其抗肿瘤作用同时降低其毒副作用，是一种极有临床应用前景的紫杉醇新剂型。
紫杉醇PluronicP123胶束;给药系统;药效学分析;抗肿瘤作用;毒副作用
山东大学
硕士
药剂学
张娜;张建
2013
中文
R979.1
97
2013-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）