耐热中性脂肪酶产生菌Pseudomonas sp.ZBCl的筛选及发酵条件的优化
脂肪酶（三酰基甘油酰基水解酶E.C.3.1.1.3）能催化水解三酰基甘油类生成甘油二酯、甘油单酯、甘油和游离的脂肪酸，而在非水解介质中，能催化酯类的逆向合成反应。由于微生物脂肪酶具有较高的稳定性、选择性和底物特异性，所以被广泛应用于各种生物技术领域。目前，脂肪酶除了被广泛应用于洗涤、造纸和化妆品合成工业，在食品工业上也有大量的应用，特别是利用脂肪酶作为生物催化剂，催化酯交换反应。通过酶法酯交换可以改善油脂的物理性质，得到人们需求的新型油脂。酯交换可以代替部分氢化作用不生成反式脂肪酸。已有大量文献报道，反式脂肪酸的食入会促进冠心病、糖尿病及癌症的发生。
在自然界中脂肪酶普遍存在，但只有微生物脂肪酶具有比较重要的商业价值。目前，已报道的工业脂肪酶主要来自于酵母菌、真菌和细菌。假单胞菌脂肪酶具有独特的性质满足工业应用，特别是食品工业。但是，由于假单胞菌脂肪酶的价格高，产量低，所以提高脂肪酶产量是应用于工业的关键。统计设计试验是对试验进行指导和设计，从而利用最少的试验获得最多的信息。本文以脂肪酶为研究对象，开展脂肪酶生产菌株的筛选、鉴定、酶学性质的研究及发酵条件优化，为进一步工业化应用奠定基础。
对40株分离于富油土壤的微生物进行产脂肪酶筛选，发现16株是脂肪酶生产菌株。利用橄榄油RhodamineB平板和液态摇瓶发酵的方法，筛选出3株活力较高的菌株ZBC1、ZBC2和ZBC3进行下一步研究。经16SrRNA序列分析，结合菌株形态和生化特征，初步鉴定这3个菌株分别为Pseudomonassp.ZBC1、Burkholderiasp.ZBC2和Klebsiellasp.ZBC3。通过液态摇瓶发酵研究，Pseudomonassp.ZBC1在发酵48h后达到最大酶活力8.5U/mL;Burkholderiasp.ZBC2在发酵120h后达到最大酶活力8.25U/mL;Klebsiellasp.ZBC3在发酵72h后达到最大酶活力8.25U/mL。选择Pseudomonassp.ZBC1为出发菌株，进行下一步的酶学性质研究和发酵条件的优化。
对Pseudomonassp.ZBC1脂肪酶的酶学性质进行研究:脂肪酶的最适作用温度为80℃，并且在这个温度下具有较好的稳定性;最适作用pH值为7.0，并且在pH值为6.5-9.0之间具有较好的稳定性。
通过单因素单因子试验优化Pseudomonassp.ZBC1的发酵条件。研究表明:菌株发酵的最佳碳源为麦芽糖，次之为蔗糖、淀粉、甘油和酵母提取物，葡萄糖对菌株产酶具有抑制作用;无机氮源(NH4NO3)和有机氮源（黄豆粉）作为菌株发酵的最佳氮源;菌株发酵培养基最适初始pH值为6;250mL的三角锥型瓶，最适装瓶量为50mL;当菌种种龄为16h，接种量为15％时，菌株的产酶量达到最大值;添加0.7mg/mLMgSO4和0.5mg/mLNa2HPO4时，更有利于酶的产生。由于单因素单因子法不能考察因素间的交互作用，从而不能精确获得最佳的优化配方。为了弥补单因素单因子实验的缺陷，本研究将单因素单因子法和统计设计方法结合起来优化Pseudomonassp.ZBC1产脂肪酶的发酵条件。Plackett-Burman(PB)设计从10个对酶产量有影响的因子（黄豆粉、NH4NO3、MgSO4、Na2HPO4、pH、接种量、装瓶量、蔗糖、橄榄油和麦芽糖）中筛选出3个显著性影响因子分别为:MgSO4、接种量和装瓶量。通过响应面方法来优化发酵条件，当MgSO4，接种量和装瓶量分别为0.85g/L、6.59％和51.57mL时，为菌株发酵的最佳条件。通过培养基优化后，酶的产量提高了2.3倍(从8.5U/mL提高到19.5U/mL)。
假单胞菌属;中性脂肪酶;响应面方法;产生菌Pseudomonas sp．ZBCl;发酵条件;筛选工艺
安徽大学
硕士
微生物学
张部昌
2012
中文
TQ925.6
73
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）