降解赤霉病毒素Tri101基因转化小麦成熟胚的研究
小麦作为主要的粮食作物，在世界栽培谷物中小麦的种植面积居首位，总产量居于第二，仅次于玉米。近年来，赤霉病是影响中国小麦生产的重要病害之一。赤霉病多次发生大流行于我国西北的麦区、黄淮海平原麦区，严重影响着小麦的生长和品质，造成了很大的损失。目前，在选育抗赤霉病品种方面还没有获得突破性进展。研究表明，Tri101基因编码的是单端孢酶烯3-O-乙酰转化酶，这种酶与镰刀菌抵抗自身毒素有关。本研究利用pCAMBIA3304-Tri101植物表达载体，通过植物基因工程的方法，将Tri101基因导入小麦中进行稳定遗传并特异性表达，以便降低小麦赤霉病的发病率。本实验是在借鉴前人研究的基础上改进的成熟胚转化方法。创新点在于选择某一发育时期阶段的萌动胚进行微损伤后，利用表面活性剂Silwet L-77和真空渗透辅助农杆菌介导转化小麦成熟胚。研究结果表明，表面活性剂Silwet L-77和真空渗透对提高小麦的转化率均有一定的效果，这为探索一种更简捷、高效的小麦转基因方法提供了一定的科学参考依据。本实验的主要内容及结果有3个方面:
1.划伤种胚对小麦转化频率的影响
分别用含有外源基因的农杆菌菌液浸染未划胚、划胚的小麦萌动种胚，分析划胚对小麦遗传转化的影响。通过Gus组织化学染色检测，结果表明，划胚浸染后的转化幼苗，在胚根、胚芽鞘以及胚的生长点部位，都有蓝色斑点的出现，而未经划胚浸染后的转化幼苗，仅在胚根及胚芽鞘的表皮有少许的蓝色斑点出现。因此，本实验认为，划胚后的小麦胚，在其伤口处能分泌出酚类化合物质，在乙酰丁香酮的作用下，利用农杆菌对其伤口的侵袭作用，使农杆菌菌液进入小麦胚生长点的组织细胞中，这有助于提高小麦成熟胚的遗传转化率。
2.划胚法转化Tri101转化小麦成熟萌动胚
首先探讨了划胚及划胚方式这两个因素对小麦遗传转化的影响，并对划胚的选择时期、菌液浓度、基因型等影响小麦遗传转化的因素做了探讨，初步建立了划胚转化转化小麦成熟胚的研究体系:在利用划胚法进行小麦遗传转化的过程中，选择了胚芽长度为1.5cm左右的小麦萌动胚作为转化受体，以双面刀纵向划伤萌动胚的划胚方式，菌液浓度OD600值为0.8，浸染时间为12h，对小麦胚进行外源基因tri101的遗传转化，通过Gus组织化学染色检测和报告基因Gfp的荧光检测，初步证明外源tri101基因己成功整合到了小麦的基因组中，但外源基因tri101是否能在小麦中稳定遗传并表达，还有待在分子水平上做进一步的研究。
3.真空渗透转化介导Tri101基因转化小麦成熟胚
利用己建立的划胚法辅助农杆菌介导转化小麦萌动胚的转化体系，首先对真空强度、真空渗透时间、菌液浓度等因素影响真空渗透转化率进行了探讨。初步建立了适于真空渗透辅助农杆菌介导小麦成熟萌动胚的转化体系.:以4110、周麦18为小麦材料，真空强度和处理时间分别为≤0.06Mpa、5min进行外源基因的遗传转化。结果显示:真空处理后，取部分转化了的幼苗进行gus瞬时表达率的检测，其中以小麦胚生长点作为统计，Gus基因的转化率为2％左右。研究证明，使用真空渗透可以更容易地使农杆菌液渗入到胚的生长点，对小麦成熟胚的转化频率有了显著提高，这为本研究能获得纯的转基因小麦植株提供了一定的参考价值。
小麦;赤霉病毒素;Tri101基因;成熟胚;遗传信息
郑州大学
硕士
遗传学
田保明;雷振生
2013
中文
Q785
66
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）