草酸氧化酶基因(OxO)转化大豆成熟胚的研究
大豆是我国非常重要的油料作物之一，是豆科植物中最富含有营养又易于消化的食物。大豆菌核病对大豆的生长危害严重，菌核病在大豆的整个生育期都可以发病，并造成叶腐、苗枯、荚腐等症状。每次发病轻则减产20％～30％，严重时减产可达到50％～90％，甚至导致绝产。在农业生产上，人们主要采取化学防治、轮作等方式防治菌核病。但实际防治效果并不明显。因此，培育出高品质的大豆品种是十分必要的。然而，传统育种所需时间过长，对后代的表现预见性较差。因此随着基因工程技术的发展，转基因育种逐渐成为现阶段获得优良作物品种的重要方法。
众多研究表明，菌核病致病与核盘菌分泌的草酸毒素有着十分重要的关系。而草酸氧化酶(oxalate oxidase，OxO，E.C.1.2.3.4)则是最主要的草酸降解酶之一。草酸氧化酶主要存在于少数的禾谷类的植物中，因它能够使草酸降解为H2O2和CO2，所以可以降解掉草酸的毒性，从而延缓病原真菌的侵染。因此我们可以将草酸氧化酶基因OxO转化进入大豆植株中，以期大豆植株获得对菌核病的抗性。
本研究以大豆成熟胚为主要研究对象，利用根癌农杆菌介导OxO基因遗传转化大豆成熟胚胚尖，并通过组织化学染色和PCR技术，初步鉴定目的基因已整合到目标材料中。在研究过程中，首先，我们建立了一种适合大豆成熟胚胚尖的再生体系，其次，我们系统分析了农杆菌浸染时间、共培养时间、恢复培养时间等因素对大豆遗传转化的影响，进而成功建立了一种适合大豆成熟胚胚尖遗传转化的体系。具体研究内容包括以下3个部分:
1.建立了一种适合于大豆成熟胚胚尖的再生体系
选取成熟光滑、表面无病斑的大豆种子→70％酒精消毒浸泡50s-1min→2％NaClO溶液浸泡大豆种子，期间不定期的摇晃20 min→无菌水清洗4-5次→无菌水浸泡24 h→剥取胚尖，将其接种于预培养基中培养2d→将外植体转接于含有3 mg/L6-BA和0.05 mg/L IBA的不定芽诱导培养基中→待不定芽生长至2-3cm时，将不定芽切下转接于含0.3 mg/L IBA的生根培养基中→待不定根生长茁壮时，炼苗移栽。
2.建立了一种适合于大豆成熟胚胚尖外植体的遗传转化体系
大豆种子消毒后浸泡过夜→剥取胚尖，预培养基中培养2 d→农杆菌LBA4404/3303-OxO活化、培养→用OD600=0.6-0.8 ABS的浸染液浸染胚尖外植体20 h，共培养基中暗培养5 d→清洗两次外植体，恢复培养7 d→筛选培养30d，每隔10d更换一次培养基→将经过筛选存活下来的抗性芽诱导生根→待不定根长至茁壮的时候，便可将其炼苗，移栽于营养土中。
3.转基因大豆苗的组织化学检测与鉴定
取经过筛选存活下来的大豆苗的新鲜叶片，分别进行GUS组织化学染色，gfp荧光显微观察及PCR检测。结果显示:有6株转化苗的叶片被染成了蓝色，且可以观察到绿色荧光，PCR也扩增出了与阳性对照相同的条带。结果表明外源基因OxO已成功整合至大豆基因组中。
草酸氧化酶基因;毒性作用;成熟胚;遗传信息;大豆
郑州大学
硕士
遗传学
田保明
2013
中文
Q344.14
78
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）